Box-Benhken响应面法优化超声提取天冬中皂苷的工艺

刘梦迪，梁德勤，金传山，张　伟，刘成伟，赵园园

(安徽中医药大学药学院，安徽 合肥　230012)



Box-Benhken响应面法优化超声提取天冬中皂苷的工艺

刘梦迪，梁德勤，金传山，张伟，刘成伟，赵园园

(安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012)

目的优化天冬中皂苷的超声提取工艺，为质量检测提供基础。方法以紫外可见分光光度法测定天冬中皂苷的含量，并比较菝葜皂苷元与薯蓣皂苷元对照品与天冬样品的最大吸收波长，采用单因素实验法及Box-Benhken响应面法设计天冬皂苷的超声提取实验，并对Box-Benhken响应面模型进行方差分析。结果薯蓣皂苷元的最大吸收波长与天冬样品最大吸收波长相近。响应面分析的最佳提取条件为：乙醇浓度为48%，液料比为50 mL/g，超声时间为61 min。天冬皂苷的含量预测值为5.10%，验证试验的天冬皂苷含量的平均值为5.07%。结论选择薯蓣皂苷元作为对照品，可以较好地反映天冬皂苷含量水平。响应面法建立的天冬皂苷含量模型具有良好的实际指导意义，可作为进一步研究天冬的实验基础。

天冬；天冬皂苷；响应面；超声提取

天冬原名天门冬，始载于《神农本草经》，为百合科植物天冬Asparaguscochinchinensis(Lour.) Merr.的干燥块根，具有养阴润燥、清肺生津的功效[1]。天冬皂苷类成分主要包括以菝葜皂苷元、薯蓣皂苷元、雅姆皂苷元等皂苷元为非糖部分的多种甾体皂苷[2]，是天冬中主要有效成分。药理研究[3-5]也显示，天冬中皂苷类成分具有抑菌、抗肿瘤、提高机体免疫能力等药理活性。

目前研究天冬中总皂苷的提取优化方式多采用正交实验法[6]，而Box-Benhken响应面法可以较系统地优化多个因素影响的工艺条件[7]。目前尚未见到采用响应面法优化天冬中总皂苷的超声提取条件的文献报道。因此，本研究以天冬总皂苷含量为指标，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化超声提取天冬中皂苷的条件，以期为天冬相关加工工艺的质量评价指标的选取提供依据，同时为天冬的进一步研究提供理论指导。

1　材料

SPECORD S600紫外-可见分光光度计：德国耶拿分析仪器股份公司；Milli-QAdvantage 超纯水机：苏州赛恩斯仪器有限公司；AS20500BDT 超声波清洗机：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；FA-2004型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；CP2225-D型十万分之一电子天平：Sartorius公司；HH-4数显恒温水浴锅：江苏省常州普天仪器制造有限公司；R-1001N型旋转蒸发仪、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：河南省郑州长城科工贸有限公司；纯水自制；95%乙醇、甲醇、正丁醇、冰醋酸等试剂均为分析纯。

薯蓣皂苷元(批号 CFN99515)、菝葜皂苷元(批号 CFN99779)：湖北省武汉天植生物技术有限公司；天冬样品收自广西玉林中药材市场，经安徽中医药大学刘守金教授鉴定为百合科植物天冬Asparaguscochinchinensis(Lour.) Merr.的干燥块根。

2　方法

2.1天冬皂苷测定方法的确立

2.1.1对照品溶液的制备精密称取薯蓣皂苷元对照品4.16 mg及菝葜皂苷元对照品6.46 mg，分别加甲醇定容至25 mL容量瓶中，摇匀即得。

2.1.2样品溶液的制备精密称取天冬粗粉(过二号筛)1 g，置100 mL具塞锥形瓶中，精密量取50 mL 50%乙醇，摇匀，超声30 min，过滤，取25 mL续滤液，水浴蒸干，加水定容至10 mL容量瓶中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次约10 mL，合并萃取液，减压回收至干，残渣加甲醇定容于25 mL容量瓶中，作为供试品溶液。

2.1.3波长的选择精密吸取薯蓣皂苷元对照品溶液及菝葜皂苷元对照品溶液各0.4 mL、供试品溶液0.5 mL置具塞试管内，水浴蒸干后，分别加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，混匀密塞，水浴60 ℃显色15 min，立即冷却5 min，再加入5 mL冰醋酸稀释，摇匀。空白对照为甲醇，用上述方式显色，在400～800 nm波长下进行扫描。

2.1.4绘制标准曲线分别精密吸取薯蓣皂苷元对照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，置具塞试管中，水浴蒸干后，照“2.1.3”项下方法显色，空白对照为甲醇，在456 nm处测吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，薯蓣皂苷元质量(x)为横坐标，绘制标准曲线。

2.1.5精密度试验精密吸取“2.1.1”项下薯蓣皂苷元对照品溶液6份，按照“2.1.3”项下方法显色后测定吸光度。

2.1.6重复性试验精密称取同一样品6份，按照“2.1.2”项下方法制备样品，测定吸光度。

2.1.7稳定性试验取同一样品溶液，按照“2.1.3”项下方法显色后，每隔15 min测定吸光度，记录1 h内吸光度值。

2.1.8加样回收率试验精密称取已知含量的天冬样品1 g，共6份，按照“2.1.2”项下方法制备样品，吸取各样品溶液1 mL，分别加入一定量的薯蓣皂苷元对照品，按照“2.1.3”项下方法显色后测定吸光度，计算加样回收率。

2.2超声提取天冬皂苷的单因素实验本实验在查阅文献的基础上，选取乙醇浓度、液料比、超声时间为3个因素，分别设置7个水平，按照“2.1.2”项下进行样品溶液的制备，固定液料比为50 mL/g、超声时间为30 min，考察乙醇浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%；固定乙醇浓度为50%、超声时间为30 min，考察液料比分别为10、20、30、40、50、60、70 mL/g；固定液料比为50 mL/g、乙醇浓度为50%，考察超声时间分别为20、30、40、50、60、70、80 min，并选择其中各因素的3个水平。

2.3响应面法优化天冬皂苷的实验设计在单因素实验的基础上，用Design-Expert 8.0进行响应面Box-Benhken中心组合实验设计，以乙醇浓度(A)、液料比(B)、超声时间(C)为自变量，天冬皂苷含量为响应值，设计3因素3水平的响应面实验，以优选天冬皂苷的超声提取条件。具体因素、水平见表1。

表1　超声提取天冬中天冬皂苷的响应面法实验因素及水平表

2.4验证实验称取天冬粗粉(过二号筛)1 g，按响应面法优化的提取工艺进行天冬皂苷的提取测定，平行3次，以验证工艺的可行性及重现性。

3　结果与分析

3.1天冬皂苷测定方法的确立

3.1.1波长的确定波长扫描结果显示菝葜皂苷元的最大吸收波长为535 nm(图1A)，薯蓣皂苷元的最大吸收波长为456 nm(图1B)，天冬样品的最大吸收波长(图1C)与薯蓣皂苷元相同，故选择薯蓣皂苷元为对照品，456 nm为检测波长。

图1菝葜皂苷元(A)、薯蓣皂苷元(B)和天冬样品(C)的紫外光谱图

3.1.2标准曲线的绘制由薯蓣皂苷元标准曲线拟合的回归方程为：y=3.774x+0.040 27，r2=0.999 8，表明薯蓣皂苷元对照品在0.050～0.133 mg范围内其吸光度与质量之间线性关系良好。

3.1.3精密度试验经测定薯蓣皂苷元的RSD值为1.35%，表明紫外-可见分光光度计的精密度良好。

3.1.4重复性试验重复性试验中样品含量的RSD值为1.41%，表明天冬皂苷测定方法的重复性良好。

3.1.5稳定性试验经测定，样品含量的RSD值为0.59%，表明样品溶液在1 h内稳定性良好。

3.1.6加样回收率试验加样回收率实验结果见表2，天冬样品的平均回收率为99.10%，天冬样品加样回收率的RSD为1.99%。

表2　天冬样品加样回收率测定结果

3.2单因素实验结果与分析采用“2.1.2”项下样品制备方法，固定液料比为50 mL/g，超声时间为30 min，考察乙醇浓度为30%～90%，结果见图2A。乙醇浓度为40%～60%时，天冬皂苷含量较高，当乙醇浓度高于60%时，天冬皂苷含量下降较多。固定乙醇浓度为50%，超声时间为30 min，液料比为10～70 mL/g，结果见图2B。液料比在30～60 mL/g时，天冬皂苷含量较高，液料比低于30 mL/g时，天冬皂苷提取含量低，可能由于溶液中天冬皂苷已达到饱和，但提取不完全所致。固定液料比为50 mL/g，乙醇浓度为50%，超声时间20～80 min，结果见图2C。时间在50～70 min内，天冬皂苷含量较高，低于或高于此时间段，天冬皂苷含量均降低，因此超声提取时间应选合适范围。

图2乙醇浓度(A)、液料比(B)和超声时间(C)对天冬皂苷含量的影响

3.3响应面法实验结果与分析超声提取天冬皂苷的3因素3水平Box-Benhken中心组合实验设计结果见表3。其中编号1～12组为析因设计实验，编号13～17组为中心设计实验。A、B、C构成的三维空间的顶点为析因点，区域中心点为零点，零点实验共5组，用以估算实验误差。最终拟合的天冬皂苷(Y)的二次多项式方程为：Y=5.05-0.69A+0.049B+0.093C+0.050AB-0.15AC+0.96BC-1.87A2-0.60B2-0.64C2。

表3　超声提取天冬中天冬皂苷的响应面实验方案与结果

模型的各项方差分析结果及模型的决定系数可反映其可靠性，结果见表4。该模型具有统计学意义(P=0.000)，失拟项无统计学意义(P=0.110)，另外该模型的校正决定性系数RAdj2=0.999 3，说明该模型对天冬皂苷超声提取实验的拟合程度好，此实验方案可行。由A、B、C各因素的F值可知，影响天冬皂苷含量的因素从高至低依次是乙醇浓度(A)、超声时间(C)、液料比(B)。

由Design-Expert 8.0 软件对方程模型绘制天冬皂苷含量的三维响应面图(图3)，固定超声时间，天冬皂苷含量的响应值随液料比与乙醇浓度的增加而增大，当液料比为45～55 mL/g，乙醇浓度为40%～50%时，响应值最高，但A、B继续增高，响应值下降；固定液料比，Y随A、C的增加而增大，当A为40%～50%，C为55～65 min时，响应值最高，但A、C继续增高，响应值下降，这说明天冬皂苷在50%左右的乙醇中溶解较多，超声时间过短，则天冬皂苷溶出少，但超声时间过长又可能会导致皂苷结构的破坏或使杂质溶出增加，从而导致天冬皂苷含量减少。固定乙醇浓度，Y随B、C的增加而增大，当B为46～62 mL/g，C为56～72 min时，响应值最高，说明超声时间与液料比在合适范围内才能使天冬皂苷溶出加大。经Design-Expert 8.0软件进一步分析，得出超声提取天冬中总皂苷的最佳提取条件为：乙醇浓度为48%，液料比为50 mL/g，超声时间为61 min。在此条件下，提取天冬中天冬皂苷的含量预测值为5.10%。

3.4验证试验采用“3.3”项下优选出的最佳提取条件，采用超声提取天冬总皂苷，平行3组，所得天冬皂苷平均值为5.07%，与模型预测值5.10%相近，说明该模型具有良好的重现性。

4　讨论

目前对天冬总皂苷的测定多采用5%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸显色，通过紫外-可见分光光度法测定皂苷含量，查阅相关文献[8-10]，发现所用对照品一般为菝葜皂苷元或薯蓣皂苷元，本研究对两对照品及天冬样品进行波长扫描，发现天冬样品的最大吸收波长与薯蓣皂苷元最大吸收波长相近，因此选择薯蓣皂苷元作为天冬总皂苷的对照品，以更好地反映天冬总皂苷的含量水平。

表4　模型各项的方差分析结果

图3液料比与乙醇浓度(A)、超声时间与乙醇浓度(B)以及超声时间与液料比(C)对天冬皂苷含量的交互作用的响应面图

超声提取天冬总皂苷的响应面中心组合实验所拟合的二次多项式方程具有统计学意义(P<0.05)，其失拟项无统计学意义(P>0.05)，且校正决定性系数R2=0.999 3，反映该方程模型可以较好地预测天冬皂苷的提取量，具有实际意义。方程中各项的方差分析均具有统计学意义，且从模型中可看出乙醇浓度、液料比及超声时间对天冬皂苷含量不是简单的线性关系，因此采用Box-Benhken响应面模型能更好地预测天冬皂苷的提取条件。最终优化的最佳提取条件为乙醇浓度为48%、液料比为50 mL/g、超声时间为61 min，天冬皂苷的含量预测值为5.10%。经验证，此提取条件具有重现性及可行性，可为天冬的后期研究提供理论基础。

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Optimization of Ultrasonic Extraction of Saponins fromAsparaguscochinchinensisby Response Surface Methodology with Box-Behnken Design

LIUMeng-di,LIANGDe-qin,JINChuan-shan,ZHANGWei,LIUCheng-wei,ZHAOYuan-yuan

(SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

ObjectiveTo optimize the ultrasonic extraction of saponins fromAsparaguscochinchinensis,and to provide a basis for quality evaluation.MethodsThe content of total saponins inAsparaguscochinchinensiswas determined by ultraviolet spectrophotometry,and the maximum absorption wavelengths of sarsasapogenin,diosgenin,andAsparaguscochinchinensiswere compared.The single-factor experiment and response surface methodology with Box-Behnken design were used to design the ultrasonic extraction experiment for saponins fromAsparaguscochinchinensis.An analysis of variance was performed for the model of the response surface methodology with Box-Behnken design.ResultsThe maximum absorption wavelength of diosgenin was similar to that ofAsparaguscochinchinensis.The optimal extraction conditions by the response surface method were as follows:an ethanol concentration of 48%,a liquid-solid ratio of 50 mL/g, and an ultrasonic extraction time of 61 min.The predicted content of saponins inAsparaguscochinchinensiswas 5.10%.The average content of saponins inAsparaguscochinchinensisin verification test was 5.07%.ConclusionDiosgenin is a good

ubstance to reflect the content of saponins inAsparaguscochinchinensis.The saponins content model established by response surface methodology has a good guiding significance and can be used as the foundation of further research onAsparaguscochinchinensis.

Asparaguscochinchinensis; Saponin; Response surface; Ultrasonic extraction

国家中医药管理局中医药行业科研专项(201507002-2)；安徽高校科研创新平台团队项目(皖教秘科〔2015〕49号)

刘梦迪(1992-)，女，硕士研究生

金传山，jcs4@sohu.com

R284.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.05.026

2016-05-19；编辑：姚实林)