不同生长时期凤丹内生真菌的分离鉴定及多样性研究

张培良，王国凯，郁　阳，刘劲松，王举涛，许凤清，马宗慧，张　楠，王　刚

(安徽中医药大学药学院　现代中药安徽省工程技术研究中心，安徽 合肥　230012)



不同生长时期凤丹内生真菌的分离鉴定及多样性研究

张培良，王国凯，郁阳，刘劲松，王举涛，许凤清，马宗慧，张楠，王刚

(安徽中医药大学药学院现代中药安徽省工程技术研究中心，安徽 合肥230012)

目的对不同生长时期凤丹根皮内生真菌进行分离鉴定。方法运用组织分离法进行分离，采用形态学与分子生物学相结合的手段进行鉴定。结果共得到内生真菌45株，分属于9属13种，其中枯萎期4属4种，分别为FusariumKeratoplasticum、Myrotheeiumprestonii、Septoriellaphragmitis、Cosmosporacymosa，相对分离频率为40%。花期6属9种，分别为Fusariumacutatum、Fusariumcircinatum、Fusariumfujikuroi、Alternariaalternata、Alternariaarborescens、Climacocystismontana、Pyrenochaetalycopersici、Penicilliumcrustosum、Rhexocercosporidiumpanacis，相对分离频率为60%。结论凤丹根皮中内生真菌组成丰富，且在不同生长时期其种类组成具有多样性。

凤丹；内生真菌；分离；鉴定

凤丹(PaeoniaostiiT. Hong et J. X. Zhang)，其根皮称“凤丹皮”[1]。凤丹皮为安徽四大道地药材之一，富含丹皮酚等多种生物活性成分。现代药理学研究[2-5]表明，凤丹皮具有抗菌、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血压、降血糖、镇静、抗惊厥、保肝等作用。

内生真菌是指在某一段时期生活在植物组织内，对植物没有引起明显病害症状的真菌[6]。近年来研究表明，内生真菌能够促进宿主植物生长和抗逆性以及产生与宿主植物相同或相近的代谢产物，是药材形成道地性的关键因子[7]。目前，对凤丹的研究主要集中在化学成分的分析、分离和药理作用方面。本研究对凤丹的内生真菌组成进一步研究，以期为研究凤丹药材道地性以及寻找新型药用微生物资源奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料供试药材地上部分枯萎期以及花期健康植株：分别于2016年1月和3月采自安徽省铜陵市凤凰山，经安徽中医药大学方成武教授鉴定为凤丹(PaeoniaostiiT. Hong et J. X. Zhang)。马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基：不含抗生素，由北京奥博星生物技术有限责任公司提供。LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD双人单面洁净工作台：苏州苏洁净化设备有限公司；TGL-16G台式离心机：上海安亭科学仪器厂；SPT-P250C智能生化培养箱：合肥华德利科学器材有限公司；T-Gradient Thermoblock PCR仪：德国Biometra公司；G-BOX凝胶成像系统Gene-Snap：英国Syngene公司；DYY-8C电泳仪：北京六一仪器厂；植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司；通用引物：为内转录间隔区ITS1(5′-TCCGTAGGTGA-ACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，均由上海生工生物工程股份有限公司定制。

1.2内生真菌分离方法取新鲜凤丹根皮切成约0.5 cm的小段，置于无菌小烧杯中。无菌操作方法：依次用75%的乙醇浸洗2～3 min，3%的次氯酸钠浸洗3～5 min，75%的乙醇浸洗30 s，无菌水冲洗4～6次，然后用无菌滤纸吸干多余水分，再用无菌刀片将材料切成0.2 cm×0.2 cm的小块段。将上述组织块接种于PDA培养基上，每个培养皿中接种4块组织块，置26 ℃恒温培养箱中培养5～15 d。观察到培养基上从各植物组织块内部向周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法将真菌转移到新的培养基上继续培养、转接，按上述培养条件继续培养2～3代，确保所得菌为纯菌。取最后一次冲洗用的无菌水200 μL涂布于PDA培养基表面，平行3份，作为空白对照。

1.3内生真菌菌落形态观察与鉴定对照《真菌鉴定手册》[8]，根据所分得的真菌菌落、培养特征、菌丝形态、产孢结构类型以及孢子的形态、颜色、大小进行初步鉴定分类。

1.4内生真菌DNA提取已纯化的菌株接种于PDA培养基中，26 ℃恒温避光培养5～7 d。用无菌药匙将培养基上长满的菌丝刮出置于无菌研钵中，参照试剂盒步骤进行操作得到DNA溶液，置于-20 ℃冰箱中保存、备用。

1.5目的片段的扩增和测序扩增真菌rDNA-ITS的上游引物ITS 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反应体系50 μL，其中内切酶25 μL，ITS1(20 μmol/ L)2 μL，ITS4(20 μmol/L)2 μL，双蒸水19 μL，DNA模板2 μL。

PCR扩增程序：预变性95 ℃，5 min，变性95 ℃，1 min，复性49 ℃，1 min，延伸72 ℃，2 min，30个循环，最后延伸72 ℃，10 min。扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳检测，三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液，以100 V电压电泳约40 min，溴化乙锭染色5 min，由凝胶成像系统进行观察，拍照。检测后置于-20 ℃冰箱中保存，备用。将PCR扩增产物进行测序。将测序结果提交至GeneBank数据库，与相关种属序列进行同源性比较，并进行系统发育树分析。

1.6序列分析和系统发育树的构建利用NCBI数据库BLAST对序列进行相似性分析，同时采用Clustal X 1.81将序列对齐，利用MEGA 4.0软件进行系统发育分析，并以自展法进行检测，共循环1 000次，构建邻接树。

1.7分析方法内生真菌的定植率可以反映宿主植物受内生真菌侵染的程度[9]，而相对分离频率可以衡量植物组织中某种内生真菌的优势度[10]，分别按以下方法计算：

定植率=受内生真菌侵染的组织块数/全部供试样本组织块数×100%；

相对分离频率=分到的某种内生真菌的菌株数/分离到的总菌株数×100%。

2　结果

2.1不同生长时期凤丹内生真菌系统发育树构建通过组织分离法从凤丹中共分离得到9属13种内生真菌。对比分离得到的13种内生真菌与其同源性相似的13种已知菌种的16 S DNA序列，利用MEGA 4.0和Clustal X 1.81构建系统发育树。结果见图1。

图1　内生真菌ITS序列系统发育树

2.2内生真菌形态学观察对分离得到的内生真菌进行菌落特征以及显微观察，菌株FD1、FD3、FD5、FD7、FD13长有茂密的白色菌丝，呈棉絮状，其中含有大量的分生孢子，隔膜明显，多为3～5隔，5～7 d后菌丝开始变成黄褐色，在显微镜下，菌丝呈无规则状分布，孢子散落在菌丝中。菌株FD6表面分生孢子球形、椭圆形或梨形，灰褐色，不易散落，显微镜下菌丝呈墨绿色，孢子散落其中。菌株FD9表面分生孢子呈球形，黄褐色，易散落，显微镜下呈浅绿色，不规则状聚集分布。菌株FD2、FD4、FD8、FD10、FD11、FD12因不产孢子，形态鉴别无意义，故只能通过分子学鉴定。见图2。

2.3rDNA-ITS序列PCR扩增产物凝胶电泳对分离得到的内生真菌提取DNA，得到DNA提取液，进行rDNA-ITS序列扩增，550 bp左右处出现一条单一明亮的条带。见图3。

注：M. marker; 1. FD1; 2. FD2; 3. FD3;4. FD4; 5. FD5; 6. FD6; 7. FD7; 8. FD8; 9. FD9; 10. FD10; 11. FD11; 12. FD12; 13. FD13。

图3内生真菌16 S rDNA的PCR产物凝胶电泳图

2.4不同生长时期凤丹根皮内生真菌种类组成在不同时期凤丹根皮共160个组织块中，有144个组织块侵染有内生真菌，定植率为0.9，共得到内生真菌

45株，结合形态特征、ITS序列分析和系统发育分析，所得的凤丹45株内生真菌分属于9属13种，其中枯萎期凤丹根皮组织块80个，分离出内生真菌18株，共4属4种，分别为Fusarium1种、Myrotheeium1种、Septoriella1种、Cosmospora1种，相对分离频率为40%。花期凤丹根皮组织块80个，分离出内生真菌27株，共6属9种，分别为Fusarium3种、Alternaria2种、Climacocystis1种、Pyrenochaeta1种、Penicillium1种、Rhexocercosporidium1种，相对分离频率为60%。Fusarium为优势属，共有18株，其相对分离频率为40%。而Fusarium中的F.keratoplasticum与F.acutatum为凤丹的优势真菌，其相对分离频率分别为22.22%以及17.78%。见表1。

表1　凤丹内生真菌的多样性统计及其相对分离频率

3　讨论

内生真菌在植物体内是普遍存在的，但在不同生长时期内，内生真菌种类和数量具有很大的差异。曹益鸣等[11]曾对不同生长周期的茅苍术内生真菌的种类做过统计，发现内生真菌在植株不同生长期均有分布，但在苗期和花期时数量较多，种类丰富，分离率为39.6%和36.5%。另一方面，包括温度、降水等因素在内的环境因子直接作用于内生真菌，形成真菌群落的季节性演替现象。吕立新等[12]对茅苍术的内生真菌多样性进行调查，将两种化学型的茅苍术移栽至同境中，发现随着季节的变化，内生真菌群落显示出一定的演替规律，夏季内生真菌的多样性高于春季和秋季。本研究从不同生长时期的凤丹根部中共分离得到了9属13种内生真菌，其中枯萎期4属4种，共18株，花期6属9种，共27株，除了优势菌属镰刀属(Fusarium)在凤丹的枯萎期以及花期中都分离得到外，其他菌属在不同生长时期上都表现出独一性，表明凤丹内生真菌在不同生长时期，其种类和数量上具有显著性差异，花期的内生真菌丰富度大于枯萎期。且本研究所获得的凤丹内生真菌与郑艳等[13]所分离得到的内生真菌种类基本不相同，进一步丰富了凤丹内生真菌资源。对其进行分析，发现供试药材产地、采收季节以及所使用的培养基都不相同，是本研究最终所得到的内生真菌与郑艳等[13]所获得的内生真菌种类存在差异的最主要原因。

内生真菌具有合成与宿主植物相同或者相似活性成分的能力。从Stierie等[14]从红豆杉中分离到一株内生真菌Taxmyces andreanae可产生与宿主红豆杉相同的抗癌代谢产物紫杉醇以后，内生真菌产生的次生代谢产物引起了学者们广泛的关注。经过近20年的研究，除从内生真菌中分离得到与宿主相同或者相似的化合物以外，还发现种类丰富的次生代谢产物，其种类涵盖萜类、醌类、生物碱、异香豆素类、苯并呋喃类、甾体和多肽化合物、酚类等，有很多次生代谢产物十分新颖，利用植物内生真菌生产抗癌药物、杀虫剂、抑菌剂、植物激素、抗病毒剂、抗氧化剂、免疫抑制剂等均有研究报道。本研究对凤丹药用部位内生真菌组成进行初步研究，分离得到的内生真菌在相关国内外文献中未曾报道，有助于丰富凤丹内生真菌的种类资源，为进一步寻找与凤丹产生相似活性的次生代谢产物提供物质保障。

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Isolation and Identification of Endophytic Fungi fromPaeoniaostiiand Their Diversity in Different Growth Periods

ZHANGPei-liang,WANGGuo-kai,YUYang,LIUJin-song,WANGJu-tao,XUFeng-qing,MAZong-hui,ZHANGNan,WANGGang

(SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine&AnhuiEngineeringResearchCenterofModernizedChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

ObjectiveTo isolate and identify the endophytic fungi from the root bark ofPaeoniaostiiin different growth periods. MethodsTissue isolation was used to isolate the endophytic fungi fromPaeoniaostii, and morphology and molecular biology were used to identify them. ResultsA total of 45 strains of endophytic fungi were obtained fromPaeoniaostii, and they belonged to 13 species in 9 genera. The isolated endophytic fungi in withering period belonged to 4 species in 4 genera:Fusariumkeratoplasticum,Myrotheciumprestonii,Septoriellaphragmitis, andCosmosporacymosa, and the relative isolation frequency was 40%. The isolated endophytic fungi in florescence belonged to 9 species in 6 genera:Fusariumacutatum,Fusariumcircinatum,Fusariumfujikuroi,Alternariaalternata,Alternariaarborescens,Climacocystismontana,Pyrenochaetalycopersici,Penicilliumcrustosum, andRhexocercosporidiumpanacis, and the relative isolation frequency was 60%. ConclusionThere are abundant endophytic fungi in the root bark ofPaeoniaostiiand the species diversity is present in different growth periods.

Paeoniaostii; Endophytic fungus; Isolation; Identification

安徽省高校自然科学基金重点项目(KJ2016A853)；安徽省2015年公益性技术应用研究联动计划(1501ld04001)

张培良(1994-)，男，硕士研究生

王刚，kunhong_8@163.com

R931.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.05.023

2016-05-09；编辑：姚实林)