五子衍宗丸对少弱精子症模型大鼠睾丸组织Catsper1蛋白及其mRNA表达影响

黄　峰，李　莉，吴德玲，王　莉，王桐生

(1.安徽省亳州市人民医院药剂科，安徽 亳州　236800；2.安徽中医药大学中西医结合临床学院，安徽 合肥　230038；3.安徽中医药大学科技处，安徽 合肥　230012；4.安徽中医药大学针灸骨伤临床学院，安徽 合肥　230038)



五子衍宗丸对少弱精子症模型大鼠睾丸组织Catsper1蛋白及其mRNA表达影响

黄峰1，李莉2，吴德玲3，王莉4，王桐生2

(1.安徽省亳州市人民医院药剂科，安徽 亳州236800；2.安徽中医药大学中西医结合临床学院，安徽 合肥230038；3.安徽中医药大学科技处，安徽 合肥230012；4.安徽中医药大学针灸骨伤临床学院，安徽 合肥230038)

目的通过检测大鼠睾丸组织Catsper1蛋白及其mRNA表达水平，探讨五子衍宗丸治疗少弱精子症的作用机制。方法将体质量200～220 g的雄性SD大鼠随机分成正常组，模型组，生精胶囊组，五子衍宗丸低剂量、中剂量、高剂量组。采用连续灌服雷公藤多苷8周的方法复制少弱精子症模型，模型复制成功后连续给药4周。采用Western blot法测定Catsper1蛋白含量，采用荧光定量PCR法测定Catsper1 mRNA表达水平，采用酶联免疫吸附试验检测睾丸组织中cAMP含量。结果生精胶囊和高剂量五子衍宗丸能明显提高模型大鼠睾丸组织中降低的cAMP含量以及升高睾丸组织中降低的Catsper1蛋白及其mRNA表达水平(P<0.05)。结论促进Catsper1蛋白表达并参与cAMP-Ca2+正反馈可能是五子衍宗丸提高精子质量的机制之一。

五子衍宗丸；少弱精子症；Catsper1蛋白；cAMP

五子衍宗丸始载于明朝张时彻的《摄生众妙方》，由五味子、菟丝子、覆盆子、枸杞子、车前子组成，是补肾填精的经典方剂，广泛用于男性生殖系统疾病的治疗。课题组前期研究[1-2]发现，该方药能明显增加精子胞浆Ca2+含量，显著改善少弱精子症模型大鼠的精子质量。Catsper1是最早被发现并命名的精子特异性钙通道，其特异地表达于睾丸和精子，在精子的活化、顶体反应等一系列生理功能及雄性生殖功能等方面均具有重要的作用[3]。因此，本研究以Catsper1为研究对象，观察五子衍宗丸对其在少弱精子症模型大鼠睾丸组织中表达的影响，以期探讨该方药治疗少弱精子症的现代科学内涵。

1　材料

1.1动物雄性SD大鼠(SPF级)，体质量200～220 g，由安徽省实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(皖)2011-002号。

1.2药物五子衍宗丸：北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产，每次6 g，每日2次，批号 15035211。雷公藤多苷：每片10 mg，上海复旦复华药业有限公司生产，批号 150602；生精胶囊：贵州省遵义廖元和堂药业有限公司生产，每粒0.4 g，每次4粒，每日3次，批号 20150504。

1.3试剂Trizol提取剂：Invitrogen公司生产，批号 90802；逆转录试剂盒(RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit)，Thermo公司生产，批号 00221108；兔抗鼠Catsper1多克隆抗体：Bioss公司生产，批号 bs-2986R；兔抗山羊IgG：购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号 ZB2301；β-actin：购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号 TA-09；ECL超敏发光试剂盒：Thermo公司生产，批号 34094；DL2000 DNA Marker：TakaRa公司生产，批号 B7301A；环磷酸腺苷(cAMP) ELISA 检测试剂盒(大鼠)：上海沪峰生物科技有限公司生产，批号 E-14592；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.4仪器EPS300型电泳仪、VE-186型转膜仪：Tanon公司生产；RT-600型酶标仪：雷杜公司生产；K960型普通PCR仪：杭州晶格科学仪器有限公司生产；PIKOREAL 96型荧光定量PCR仪：Thermo公司生产。

2　方法

2.1动物分组及给药取雄性大鼠60只，将其随机分成正常组，模型组，生精胶囊组(阳性组，1.6 g/kg)，五子衍宗丸低剂量(1.0 g/kg，相当于成人临床用量的5倍)、中剂量(2.0 g/kg)、高剂量(4.0 g/kg)组，每组10只。除正常组外，其他各组动物每日灌服雷公藤多苷30 mg/kg(用0.5% CMC-Na制成混悬液)，连续灌服8周，复制大鼠少弱精子症模型[1]。从模型复制第5周开始，各给药组动物按剂量灌胃给药，正常组、模型组动物给予等容量蒸馏水，给药容积为10 mL/kg，给药连续4周，末次给药后30 min，用3%水合氯醛麻醉、处理动物，进行相关指标检测。

2.2睾丸组织Catsper1蛋白含量测定剪取约100 mg睾丸组织，加入RIPA细胞裂解液(内含1 mmol/L PMSF)1 mL进行裂解。12 000 r/min离心10 min，收集上清液，在10% SDS-PAGE凝胶中电泳分离、转膜。转膜完毕后，立即将蛋白膜放置到Western洗涤液中漂洗5 min。加入Western封闭液(5%脱脂奶粉)，在摇床上缓慢摇动2 h，进行室温封闭。加入1∶200稀释的Catsper1多克隆抗体一抗，缓慢摇动，4 ℃孵育过夜。加入洗涤液(TBST)进行洗涤，每次10 min，共洗涤3次。加入辣根过氧化物酶标记的二抗(按照1∶50 000比例用二抗稀释液稀释)。室温封闭2 h，加入洗涤液(TBST)进行洗涤，每次10 min，共洗涤3次。使用ECL发光试剂盒检测蛋白，采用凝胶成像系统采集图像，图片灰度值采用Image J软件进行分析。

2.3荧光定量采用PCR检测睾丸组织Catsper1 mRNA表达。

2.3.1总RNA提取取睾丸组织50～100 mg，剪碎，液氮研磨，加入1 mL TRIzol匀浆，按试剂盒说明提取总RNA。

2.3.2逆转录反应取1 μg总RNA，1 μL的10 μmol/L Oligo(dT)、DEPC水补足至12 μL，轻轻混匀，点动离心。PCR仪上加热(65 ℃)5 min，立即冰浴3 min。然后加入4.0 μL的5倍反应缓冲液-10 mmol/L三磷酸脱氧核苷混合物2 μL、1 μL的RibolockTM核糖核酸酶抑制剂、RevertAidTMM-MuLV逆转录酶 1 μL，总反应体积为20 μL。混匀，轻轻点离。42 ℃孵育混合物 60 min，70 ℃加热5 min终止反应。上述反应液即为cDNA。-80 ℃保存备用。

2.3.3荧光定量PCR扩增反应鼠Catsper1引物：上游5′-GTTGCTGGACGACTCTTTGA-3′，下游5′-CCGTTGCTTCTCTGTCATGT-3′，产物长度为130 bp；β-actin引物：上游5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，产物长度为150 bp。总反应体系：2倍SYBR Green 荧光染料混合物5 μL，上下游引物(终浓度为10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，无 RNase水2 μL，共10 μL。反应条件：95 ℃、2 min，1个循环；按95 ℃、5 s，退火延伸60 ℃、10 s，共40个循环进行扩增。采用相对定量研究分析方法，按2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

2.4睾丸组织cAMP含量测定取适量睾丸组织，按1∶9加入生理盐水匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液。按试剂盒说明，采用ELISA法检测cAMP含量。

3　结果

3.1五子衍宗丸对少弱精子症模型大鼠睾丸组织Catsper1蛋白含量及其mRNA表达水平的影响模型复制8周后，模型组大鼠睾丸组织中Catsper1蛋白含量及其mRNA表达水平明显下降，与正常组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。连续给药4周，各给药组均能提高Catsper1蛋白及其mRNA表达水平，其中生精胶囊组与五子衍宗丸中、高剂量组有明显作用，与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1和表1。

注：1.正常组；2.模型组；3.生精胶囊组；4.五子衍宗丸低剂量组；5.五子衍宗丸中剂量组；6.五子衍宗丸高剂量组。

图1　五子衍宗丸对少弱精子症模型大鼠睾丸组织Catsper1蛋白表达的影响

注：与模型组比较，*P<0.05。

3.2五子衍宗丸对少弱精子症模型大鼠睾丸组织cAMP含量的影响模型复制8周后，各组大鼠睾丸组织cAMP含量明显下降；连续给药4周，五子衍宗丸组均能提高cAMP含量，其中高剂量组作用明显，与模型组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　五子衍宗丸对少弱精子症模型大鼠睾丸组织cAMP含量的影响

注：与模型组比较，*P<0.05。

4　讨论

少弱精子症是临床男科的疑难病症，大约占男性不育症的46%[4]，其发病率逐年上升，已经成为影响社会和谐和总体生活质量的社会问题。中医无少弱精子症病名，常将其归属于“精少”“精寒”“精薄”“精冷”等范畴。其病因病机较为复杂，医家对该病症的认识多样，但大多认为其病机以肾虚为本，涉及肝脾，并与湿、热、瘀、毒、虫(感染)等有关。治疗上以补肾填精为基本大法，并充分运用辨证论治的原则，注重个体化治疗，取得了良好的治疗效果。五子衍宗丸是治疗少弱精子症的经典方剂和基本方剂，方中菟丝子温肾益精，枸杞子滋肾填精，共为君药；五味子益气补虚、强阴涩精，覆盆子不燥不凝，温肾固精，共为臣药；车前子清肝肺风热，导膀胱水邪，利水而不动气，作为佐药。数药配伍，不凉不燥，达到补肾填精、疏利肾气、种嗣衍宗的功效。

Ca2+作为第二信使，与精子形态和运动能力密切相关，在精子的各个生理阶段发挥着重要作用，是精子质量的重要标志之一。研究[2,5]表明，少弱精子症模型大鼠精子胞浆Ca2+含量显著下降，并出现钙离子失稳态，Ca2+通道阻滞剂在体外可导致精子运动能力可逆性下降。由此可见，精子运动与Ca2+浓度密切关联，游离的Ca2+在精子运动中起着关键性作用。

Catsper蛋白为电压依赖性门控钙离子通道，是目前公认的哺乳动物精子细胞上最重要的阳离子通道[6]，在精子运动、精子超活化和受精过程中发挥关键的作用，Catsper1缺失的小鼠其精子基本无前向运动，超活化运动缺失，穿过透明带的能力丧失，导致不育[7]。在高活力人精子中Catsper1蛋白的表达水平显著高于低活力人精子中表达水平，少弱精子症患者精子活率以及a级精子(快速直线前向运动精子)+b级精子(直线前向运动精子)比例的降低与Catsper1蛋白的表达水平下降相关，Catsper1可能成为筛查不育人群病因的新诊断指标[8]。在精子趋化、受精过程中，cAMP是重要介质，外源性cAMP可升高精子细胞内Ca2+浓度，精子的Catsper通道缺失，cAMP诱导Ca2+内流的作用消失，给予外源性Catsper蛋白后，cAMP又恢复对Ca2+浓度的诱导作用。而且Catsper1参与了cAMP-Ca2+正反馈回路，在Catsper1介导下cAMP引起精子中Ca2+浓度增加的同时，cAMP的含量也显著增加[9]。

本研究表明，少弱精子症模型大鼠睾丸组织中cAMP含量明显下降，Catsper1蛋白的表达显著降低，提示Catsper1蛋白表达降低可能是导致精子运动能力下降的分子机制之一。五子衍宗丸能明显提高少弱精子症模型大鼠睾丸组织中cAMP含量及Catsper1蛋白的表达，故推测该方药改善精子质量与促进Caspter1表达并参与cAMP-Ca2+正反馈有关。

[1]王秋萍，王桐生，龙子江，等.五子衍宗丸对少弱精症模型大鼠精子质量及睾丸组织的影响[J].中成药，2011,33(10)：1796-1797.

[2]Wang TS，Huang JL，Wu DL，et al. Effect of Wuziyanzong Pill on sperm quality and calcium ion content in oligoasthenospermia rats[J]. J Tradit Chin Med, 2012,32(4), 631-635.

[3]姚丽娟，郑圣霞，吴双正，等. 钙离子通道蛋白Catsper在吸烟小鼠模型中的表达[J].实用医学杂志，2014,30(3)：357-360.

[4]孙丽仁，陈胜辉，熊青，等.补肾强精颗粒治疗男性少弱精子症的疗效观察[J].现代诊断与治疗，2015，26(5)：989-990.

[5]李路，刘继红.钙通道拮抗剂作用机制及其对人类精子的影响[J].中华男科学，2003,9(9)：700-707.

[6]郑莉萍，李葆明，曾旭辉. 精子特异性钙离子通道Catsper及其功能调控[J].生理科学进展，2012，43(1)：55-58.

[7]王世平，吕魏峰，孙秀斌，等.生精散对大鼠精子特异性钙通道的影响[J].中华中医药杂志，2013，28(6)：1692-1695.

[8]Chung JJ, Navarro B, Krapivinsky G, et al. A novel gene required for male fertility and functional Catsper channel formation in spermatozoa[J]. Nat Commun，2011，11(2)：153.

[9]伍克佳，黄东晖.精子获能中信号转导途径的研究进展[J].生殖与避孕，2015,35(7)：472-476.

Effect of Wuzi Yanzong Pill on Protein and mRNA Expression of Catsper1 in Testicular Tissue of Rats with Oligoasthenozoospermia

HUANGFeng1,LILi2,WUDe-ling3,WANGLi4,WANGTong-sheng2

(1.DepartmentofPharmacy,ThePeople’sHospitalofBozhou,AnhuiBozhou236800,China; 2.ClinicalSchoolofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China;3.DepartmentofScienceandTechnology,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China;4.ClinicalCollegeofAcupunctureandOrthopedics,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of action of Wuzi Yanzong Pill in the treatment of oligoasthenozoospermia through the measurement of protein and mRNA expression of Catsper1 in testicular tissue in rats. MethodsMale Sprague-Dawley rats with a body weight of 200-220 g were randomly divided into normal group, model group, Shengjing Capsule group, and low-, medium-, and high-dose Wuzi Yanzong Pill groups. The rat model of oligoasthenozoospermia was established by the treatment with tripterygium glycoside by gavage for 8 consecutive weeks, and after the model was successfully established, the drugs were administered for 4 consecutive weeks. Western blot was used to measure the content of Catsper1 protein, fluorescence quantitative PCR was used to measure the mRNA expression of Catsper1, and enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the content of cAMP in testicular tissue. ResultsThe Shengjing Capsule group and the high-dose Wuzi Yanzong Pill group showed significant increases in the reduced content of cAMP and the reduced protein and mRNA expression of Catsper1 in the testicular tissue (P<0.05). ConclusionWuzi Yanzong Pill improves the quality of sperms through promoting the expression of Catsper1 and being involved in cAMP-Ca2+positive feedback.

Wuzi Yanzong Pill; Oligoasthenozoospermia; Catsper protein; cAMP

国家自然科学基金项目(81473674)；安徽中医药大学大学生创新创业基金项目(2015032)

黄峰(1974-)，男，硕士，主管中药师

王桐生，wtsyl@163.com

R256.56[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.05.021

2016-05-10；编辑：姚实林)