氯胺酮对鼠大脑皮层离体神经元氨基酸类神经递质分泌的影响

孔祥星，郭岑，李欣然，师铭咸，高利

（东北农业大学动物医学学院外科教研室，黑龙江哈尔滨150030）

氯胺酮对鼠大脑皮层离体神经元氨基酸类神经递质分泌的影响

孔祥星，郭岑，李欣然，师铭咸，高利

（东北农业大学动物医学学院外科教研室，黑龙江哈尔滨150030）

为研究氯胺酮对氨基酸类神经递质的影响，明确其中枢作用机制，为今后科学合理用药提供依据，试验将Wistar大鼠大脑皮层神经元进行离体培养，在培养第7天加入1 μg/mL、3 μg/mL、5 μg/mL氯胺酮，分别在加药后0、5、10、15、20、25、30、45、60、90、120 min取上清液40 μL检测Glu、Asp、Gly和GABA的含量。不同剂量氯胺酮作用于神经细元后Asp都显著升高，Gly和GABA都显著降低，且3 μg/mL和5 μg/mL氯胺酮作用效果明显，而1 μg/mL作用后Glu的含量升高，3 μg/mL、5 μg/mL却降低。结果表明氯胺酮直接作用于神经元后，通过抑制兴奋性氨基酸神经递质Glu和Asp的合成和分泌及增强抑制性神经递质Gly和GABA的释放来达到麻醉作用。且氯胺酮的麻醉作用强弱与剂量大小有一定的相关性。

氯胺酮；Wistar大鼠；神经细胞；天冬氨酸；γ-氨基丁酸

氯胺酮作为动物临床常用静脉麻醉药物，良好的镇痛作用，作为分离麻醉剂，氯胺酮能够选择性地作用于大脑的联络经路和丘脑-新皮层系统，表现为疼痛与意识的分离现象。氯胺酮很少单独应用，多数用于基础麻醉或与其他药物复合麻醉，来减少麻醉药的用量，降低其毒副作用，并提高麻醉效果，扩大安全范围。

近年来，关于氯胺酮对中枢神经系统的影响的研究一直是临床研究的热点，目前普遍认为氯胺酮产生麻醉作用机制是它与NMDA受体有关，氯胺酮可以调节突触后受体的神经传递，作为一种非竞争性的拮抗剂，氯胺酮会阻断NMDA受体并引起分离麻醉［2］。而氨基酸类神经递质谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）和γ-氨基丁酸（GABA）是中枢重要的一类小分子神经递质，在大脑中，Glu和Asp介导了大部分的兴奋性突触传递过程，而Gly和GABA作用正好相反。关于氯胺酮对氨基酸类神经递质影响及影响程度没见相关报道，为此，本实验通过对鼠大脑体外培养神经元给予氯胺酮，检测其氨基酸类神经递质分泌及分泌情况进行分析，研究其中枢作用机制，为今后科学合理应用提供依据。

1试验材料

1.1实验动物Wistar大鼠50只，体重200±20 g，雌雄兼用，孕16～18 d Wistar大鼠3只，哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供。

1.2主要试验试剂盐酸氯胺酮注射液：沈阳市兽药厂，20100701，甘氨酸（Gly）标准品，L-谷氨酸（L-Glu）标准品，天冬氨酸（Asp）标准品，γ-氨基丁酸（GABA）标准品，由美国Sigma公司提供。

1.3试验器械Waters 600高效液相色谱仪，色谱柱：美国Waters公司生产，Symmetry C18（4.6× 150 mm，5 μm）Column；XBridge BEH Amide XP Column（2.1×100 mm，1.7 μm）；细胞培养箱，细胞培养板，氮吹仪，离心机，微量移液器，高速冷冻离心机，液氮罐，漩涡振荡器，真空抽滤器，PH计，超声波清洗器等。

2试验方法

在神经元培养前1 d进行包被培养板，在紫外线下，培养板照射30 min，加入足量的聚左旋赖氨酸来覆盖底部，微微倾斜摇动，放入培养箱中包被过夜，确保聚左旋赖氨酸在孵育期完全覆盖培养板底部。

试验时将Wistar大鼠断颈处死，常规手术消毒，开腹，从子宫中取出胎鼠后，处死，头部置于平皿中，用镊子压住两边，轻轻分离头部皮肤，镊子压住一侧，使用精细手术剪，制造大脑基部切口，切开头盖骨，分离并除去两侧头盖骨，在除去头盖骨时，尽量避免碰触大脑组织，用镊子从底部夹断大脑，转移到含有分离培养基的10 mL烧杯中，确保大脑完全浸在分离培养基（97.5 mLHBSS加入1 mL丙酮酸钠、0.5 mL葡萄糖、1 mLHEPES）中。在解剖镜下取的大脑皮质，用眼科剪将脑组织剪碎置于15 mL离心管中，沉底后留下5～10%液体，再加10 mL的分离培养基，待组织沉底后轻柔地洗2次，加入0.5 mL的胰酶，轻轻地涡旋混匀，37℃水浴锅中消化5～10 min，，弃去液体，用5～10 mL的分离培养基洗2次，用1 mL枪头，小心地吹打组织8～10次，确保分散细胞，获得细胞悬液，取10 μL分散后的细胞，加90 μL的维持培养基（含96 mL Neurobasal medium加入2 mL B-27、1 mL Gluta MAX™、1 mL青链霉素）在细胞计数板上估算活性细胞的密度，取10 μL分散后的细胞，加90 μL的维持培养基在细胞计数板上估算活性细胞的密度，活性细胞可以通过平滑有光泽的性状来鉴定，死的细胞则较暗，在6孔板上接种105～106个/mL细胞，慢慢混匀确保接种到培养板上，在细胞培养箱中37℃孵育4 h，弃去原培养液，6孔板每个孔添加2 mL的37℃的维持培养液，5%CO2，37℃下培养，24～48 h后加入阿糖胞苷，神经元的维持生长，一周两次，从孔中抽出一半的培养液，用新的37℃维持培养基代替，不要换全部的培养液，神经元分泌因子可以促进生长和存活。

神经元的鉴定方法：将多聚甲醛/蔗糖混合物加热至37℃，利于保持神经元形态。再从含有长有神经元玻片的孔中，把培养液缓慢吸出，迅速将1mL的多聚甲醛/蔗糖混合液，小心地加入到孔中以确保神经突不被损坏，置于室温10 min。弃去多聚甲醛/蔗糖混合物，加1 mL的0.1%（v/v）TritonX-100溶液到孔中，置于室温10 min。用PBS再次轻柔冲洗玻片，加1 mL的5%（wt/v）牛血清白蛋白或10%血清，置于室温1 h。加MAP2到玻片，4℃过夜。PBS冲洗玻片3次，加二抗置于室温1 h，PBS冲洗玻片3次。在一侧，加一滴抗褪色封固液，小心翻转玻片，有细胞一面向下，在封固液那一面之上，从玻片边缘，缓慢移除过量的封固液，确保玻片不会在上面移动，保持神经元形态损坏完整，载玻片放置在暗处1h，密封玻片边缘。

根据预实验结果，在神经细胞培养第7天加入1 μg/mL、3 μg/mL、5 μg/mL氯胺酮，每个浓度设置3个平行实验，分别在加药的0、5、10、15、20、25、30、45、60、90、120 min取上清液40 μL于EP管中，按照试剂盒的方法利用液相色谱仪进行检测。

原始数据通过Microsoft Excel 2003进行预处理并汇总。将预处理得到的数据通过SPSS 18.0数据分析软件进行一维方差分析，试验数据以“-X±SD”方式表示；两变量间简单相关分析采用直线相关回归分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。应用Microsoft Excel 2003制图。

3实验结果

3.1神经元培养结果连续8 d在相差显微镜下观察神经细胞培养过程中的形态变化：刚取材获得的神经元呈圆形，体积小，透亮，散在分布，种植后3 h细胞开始贴壁；培养4 d后，细胞明显增大，许多细胞从胞体长出多个突起，呈现椎形或星形。此时的神经元出现明显的形态特征，神经元胞体清晰明亮，呈明显突起状，与邻近细胞突起可以形成接触；8 d后神经元胞体增大，细胞核明显，突起进一步增多并逐渐成网，细胞间出现互相迁移靠拢，部分神经元聚集成团，可见密集的神经元细胞网络，未见明显的胶质细胞。

大脑皮质神经元培养至8 d时，进行免疫荧光染色鉴定，激光共聚焦显微镜下可见培养的皮质神经元被MAP2染色，原代培养物中富含神经元、突起走形清楚、形态良好、核大而清晰、神经元所占比例高。

3.2不同浓度氯胺酮对氨基酸神经递质的影响

如图1、2、3、4所示，1 μg/mL的氯胺酮作用于神经细胞后，Glu的含量在10 min、15 min较对照组分别升高了35%、44%，差异极显著（P＜0.05）。Asp的含量10 min较对照组升高了39%，差异极显著（P＜0.01）。Gly的含量45 min较对照组升高了35%，差异显著（P＜0.05）。GABA的含量10 min、15 min、20 min较对照组分别降低了35%、36%、35%，差异极显著（P＜0.01）；而60 min、90 min较对照组分别升高了32%、37%，差异极显著（P＜0.01）。

图1不同浓度氯胺酮作用下Glu含量变化

图2不同浓度氯胺酮作用下Asp含量变化

图3不同浓度氯胺酮作用下Gly含量变化

图4不同浓度氯胺酮作用下GABA含量变化

3 μg/mL的氯胺酮作用于神经细胞后，Glu的含量60min较对照组降低了24%，差异极显著（P＜0.01）。Asp的含量15、20、25、60、90 min较对照组分别升高59%、41%、37%、44%、46%，差异显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）。Gly的含量10 min较对照组降低了28%，差异极显著（P＜0.01）。GABA的含量10、15、20、25 min较对照组分别降低了52%、58%、43%、23%，差异显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）；而60 min、90 min较对照组分别升高了30%、54%，差异极显著（P＜0.01）。

5 μg/mL的氯胺酮作用于神经细胞后，Glu的含量10 min较对照组升高了20%，差异显著（P＜0.05）；Glu的含量25、30、45、60 min较对照组分别降低了20%、26%、33%、22%，差异显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）。Asp的含量10 min较对照组升高了45%，差异极显著（P＜0.01）。Gly的含量10 min较对照组降低了25%，差异显著（P＜0.05）。GABA的含量10 min、15 min、20 min较对照组分别降低了28%、22%、13%，差异显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）；而45 min、60 min、90 min较对照组分别升高了19%、32%、27%，差异极显著（P＜0.01）。

4讨论

已有的研究报道证实全麻药能显著增强星形胶质细胞摄取Glu的能力［3］。且均可使突触前膜Glu释放和摄取减少，提示抑制Glu释放和摄取可能是全麻药物作用的重要机制。正常情况下，Glu在谷氨酸能神经元内被摄取、聚集、储存于囊泡内，当神经元去极化时，囊泡内的Glu以Ca2+依赖方式释放于突触间隙中，与突触后不同亚型的Glu受体结合，完成兴奋性突触传递及其他生理作用［4］。

目前氯胺酮的作用机制研究主要集中于在NMDA受体上［5］。关于神经递质相关报道较少，特别氨基酸类神经递质的作用过程还不是十分明确，预实验阶段，给大鼠腹腔注射氯胺酮后，大鼠先呈现兴奋状态，后逐渐进入麻醉状态，此行为学变化与离体神经细胞培养中神经递质的变化相符，通过查阅文献报道，发现有国内学者［9］对大鼠进行麻醉，于各时期取脑组织检测Glu和Asp的含量后发现，在翻正反射消失期及深睡期两种兴奋性神经递质均呈持续下降的趋势，这可能是由于分离脑组织过程需要消耗大量时间，错过了短暂的兴奋期。此外，任家顺等研究了氯胺酮对缺血再灌注脑组织兴奋性氨基酸递质的影响，发现氯胺酮能明显升高缺血再灌注期Glu和Asp含量［6］。为了证实氯胺酮是否也存在这种作用，本实验直接通过培养Wistar鼠大脑皮层离体神经细胞，发现氯胺酮作用于神经细胞后，兴奋性氨基酸Glu和Asp的浓度均在短时间内升高，然后逐渐降低，最后恢复至接近正常水平，且高浓度的氯胺酮作用更明显。离体神经细胞培养中神经递质在氯胺酮作用下的变化与报道和我们在体实验行为学变化相符，表明氯胺酮确实是通过对兴奋性氨基酸神经递质Glu和Asp的抑制实现麻醉作用的。

国外有学者为了研究氯胺酮对大鼠皮质及海马Glu释放的影响，将葡萄糖进行标记，发现标记的葡萄糖主要在神经元的柠檬酸循环中代谢分解，标记的谷氨酸和GABA由星形胶质细胞释放及摄取［5］。在此基础上通过对在小鼠海马神经元培养中，使用膜片钳技术检测NMDA激活电流，Orser等观察到氯胺酮会通过两种机制来抑制NMDA受体，首先，它阻断了开放的通道从而减少通道的平均开放时间，其次，通过变构作用与闭合的受体相结合来减少通道的开放频率。低浓度的氯胺酮主要作用于闭合通道的阻断，高浓度的氯胺酮对开放和闭合通道都会起到一定的作用。这种双向作用可能会导致Glu分泌抑制，这可能是本次高浓度氯胺酮测定Glu发现其降低原因，该文献报道进一步证实本实验的验证结果。

如果氯胺酮单纯对兴奋性神经递质作用，而对抑制性神经递质没有作用的话，不可能产生良好的麻醉作用。

目前，氯胺酮与GABAA受体的关系尚存在争议。有研究表明，氯胺酮的麻醉作用主要通过增加GABA在中枢神经系统的含量而产生的［7］，氯胺酮在临床浓度下可增强GABA介导的抑制性突触后电流，在爪蟾卵母细胞表达的GABAA受体，氯胺酮可刺激GABA引起的氯电流，提示氯胺酮可能对GABAA受体有作用［8］。L氨基酸脱氢酶（GABA合成抑制剂）对氯胺酮产生的麻醉作用没有影响，提示氯胺酮不是通过突触前途径增强GABAA能神经传递，或不是通过神经网络的间接效能产生作用［9］。甘氨酸则是脑干和脊做突触后的抑制性神经递质，由甘氨酸激发的Cl-通道具有与GABA相似的传导特性，大多数全麻药对GABAA受体有显著的增强作用。基于此，实验也测定了抑制性神经递质Gly和GABA，发现麻醉浓度的氯胺酮作用于神经细胞后，抑制性氨基酸Gly和GABA的浓度均在短时间内降低，然后逐渐升高，最后恢复至接近正常水平，且高浓度的氯胺酮作用更明显，与兴奋性氨基酸不同的是，氯胺酮作用于神经细胞后，抑制性氨基酸呈现了完全相反的变化趋势。

5结论

麻醉浓度的氯胺酮直接作用于神经细胞后，通过抑制兴奋性氨基酸神经递质Glu和Asp的合成和分泌及增强抑制性神经递质Gly和GABA的释放来达到麻醉作用。且氯胺酮的麻醉作用强弱与剂量大小有一定的相关性。

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Effects of Ketamineon theNeurocyteCulturein vitro in Fetal Rat

KONG Xiang-xing，GUO Cen，LI Xin-ran，SHI Ming-xian，Gao Li
（Institute of Animal Medicine Surgery Teaching and Research Section，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

To study the effects of ketamine on amino acid neurotransmitters and to clarify the mechanism of central nervous system，the Wistar rat cortical neurons were cultured in vitro with the addition of，1 μg/mL，3 μg/mL，5 μg/mL ketamine in the seventh day. Supernatant was couecred for the detection of the content of Glu，Asp，Gly and GABA，after 0，5，10，15，20，25，30，45，60，90 and 120 min.The results showed that Asp increased significantly at different doses of ketamine，and Glu and GABA were significantly lower. 3 μg/mL and 5 μg/mL ketamine had obvious effects，Further more，Glu content was increased after the addition of 1 μg/mL ketamine. The results showed that ketamine acted directly on nerve cells by inhibiting excitatory amino acid neurotransmitter synthesis and secretion of Glu and Asp and enhancied the inhibitory neurotransmitter GABA Gly and release to achieve a narcotic effect.These data suggest that there is an association between the anesthesia activty of ketamine and the doses used.

Ketamine；Wistarrat；nerve cell；Asp；GABA

GAO Li

S859.791

A

0529-6005（2016）08-0101-04

2016-01-07

国家自然科学基金（31372491，31572580），黑龙江省大学生创新创业训练计划指导项目（201510224032）

孔祥星（1995-），女，本科生，就读于基础兽医学专业，E-mail：875228859@qq.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com