中哈边境艾比湖湿地游离蜱斑点热群立克次体的分子流行病学研究

徐军，王安东，罗丹，徐新龙，戴莉，杨杰，徐建军，热依罕古丽，萨尼叶古丽，王丽娜，杜景云，李志远，王远志

（1.新疆出入境检验检疫局，新疆乌鲁木齐832000；2.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000；3.石河子大学医学院，新疆石河子832000；4.阿拉山口出入境检验检疫局，新疆阿拉山口833418；5.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐830052）

中哈边境艾比湖湿地游离蜱斑点热群立克次体的分子流行病学研究

徐军1，王安东2，罗丹3，徐新龙4，戴莉4，杨杰4，徐建军5，热依罕古丽5，萨尼叶古丽5，王丽娜2，杜景云3，李志远2，王远志3

（1.新疆出入境检验检疫局，新疆乌鲁木齐832000；2.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000；3.石河子大学医学院，新疆石河子832000；4.阿拉山口出入境检验检疫局，新疆阿拉山口833418；5.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐830052）

了解中哈边境新疆艾比湖湿地游离蜱中斑点热群立克次体的感染情况。利用斑点热群立克次体外膜蛋白A（ompA）基因对艾比湖湿地游离亚洲璃眼蜱、边缘革蜱、血红扇头蜱进行PCR检测，并对阳性样本进行测序和BLAST序列分析，并应用Mega5.0软件建立分子系统进化树。结果中哈边境地区艾比湖湿地游离蜱斑点热群立克次体电泳阳性率36.84%（56/152），BLAST分析显示，艾比湖湿地游离蜱斑点热群立克次体基因型为Rickettsia raoultii，与从匈牙利患蜱传染的病人肿大淋巴结中分离获得的R.raoultii关系最近，处于同一分支（GenBank登录号为JQ798904）。结论是新疆艾比湖湿地游离蜱斑点热立克次体感染较为严重，存在立克次体自然疫源地，应尽快制定防制措施，以免危机动物及人类健康。

斑点热立克次体；游离蜱；ompA基因；分子流行病学；艾比湖湿地；阿拉山口口岸；中哈边境

1材料与方法

1.1标本采集2014年4-8月在新疆艾比湖湿地（44°43′N～45°12′N，82°35′E～83°11′E）用白布旗法采集游离蜱。

1.2蜱形态学鉴定使用体式显微镜（LEICA M165 C），以经典的形态学鉴定为主要依据，参照邓国藩［3］等国内外学者对蜱传统形态学分类方法对蜱虫进行形态学鉴定。

1.3斑点热立克次体核酸检测

1.3.1蜱虫DNA提取按照TIANamp Genomic DNA Kit说明书，进行DNA提取（1只/1份），将提取的DNA置于-20℃保存备用。

1.3.2PCR扩增根据Anstead Clare A.［4］已经报道的ompA序列进行PCR。50 μL PCR反应体系包含如下成分：25 μL 2×Taq PCR Master Mix，1 μL 10 mmol/L ompA F，1 μL 10 mmol/l ompA R，2 μL DNA模板，21 μL dd H2O。按照预变性95℃30 s，循环95℃30 s，50℃30 s，72℃30 s，35个循环，总延伸72℃300 s进行PCR扩增。

1.3.3序列分析及分子遗传进化分析选取PCR阳性产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，测序结果与GenBank中进行BLAST进行同源性分析，然后使用Mega6.0软件进行遗传进化分析，构建分子系统进化树。

2结果

2.1标本采集结果经形态学鉴定，本次调查显示，阿拉山口艾比湖湿地游离蜱隶属1科3属3种，分别为：血红扇头蜱（3.83%，15/392）、亚洲璃眼蜱（45.66%，179/392）、边缘革蜱（50.51%，198/392）。2.2立克次体核酸检测结果选取152份代表蜱种进行PCR检测，其中阳性56份，阳性率为36.84%（56/ 152）。其中：边缘革蜱66.67%（54/81）；血红扇头蜱8.33%（1/12）；亚洲璃眼蜱1.69%（1/59）。

2.3PCR电泳结果PCR扩增斑点热群立克次体的产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，可得到533 bp左右的核酸片段，与预期片段大小相符（图1）。

2.4序列分析BLAST分析显示，测序结果均为Rickettsia raouhii（R.raoultii）基因型。结合Gen-Bank数据库中的其他斑点热群立克次体种类，运用Mega 6.0软件进行多重序列比对、构建遗传进化树显示：与从匈牙利患蜱传染的病人肿大的淋巴结中分离获得的R.raoultii关系最近，处于同一分支（GenBank登录号为JQ798904）。

表1艾比湖湿地蜱类及斑点热群立克次体病原体检测结果

图1PCR扩增ompA基因

图2基于立克次体ompA基因的系统进化树

3讨论

本研究发现，阿拉山口地区斑点热群立克次体阳性率36.84%（56/152），高于疆内夏尔西里森林革蜱阳性率20%（14/70）［5］和博乐、塔城地区边缘革蜱阳性率16.22%（12/74）［6］，及东北地区森林革蝉中检出的阳性率3.7%（25/676）［7］和哈萨克斯坦边缘革蜱阳性率33.3%（6/18）［8］。可见，阿拉山口艾比湖湿地游离蜱斑点热立克次体具有高感染率，因此应当提醒当地旅游、工作人员做好防护，谨防立克次体感染。

本次调查发现，艾比湖立克次体基因为Rickettsia raoultii，与新疆哈巴、和硕、博乐和塔城地区斑点热群立克次体基因型相同［5-6］，进一步说明Rickettsia raoultii是新疆广布种。文献记载曾在哈萨克斯坦网纹革蜱、边缘革蜱、草原革蜱中分离到Rickettsia raoultii［9］。阿拉山口作为面向中亚的重要口岸，随着人员交流的日益频繁和货物的运输，增加了媒介生物随着人员和货物进出境的风险。加之阿拉山口境内的艾比湖湿地自然保护区，是新疆境内3条候鸟迁徙路线（南亚路线、印巴路线、北非路线）的枢纽位置，是候鸟迁徙的主要驿站［10］，为蜱和蜱传染原的传播提供了非常便利的自然条件。因此该基因型为边境地区长期“盘踞”还是外来入侵？这有待进一步调查和实验验证。随着“一路一带”经济带的推进，新疆对外贸易将日益增大，因此应增加边境地区媒介生物监测点，对立克次体随着货物、人员、野生动物和候鸟迁徙流动造成的疫病传播具有重要意义。

［1］张丽娟，付秀萍，范明远.我国立克次体研究与立克次体病的流行现状［J］.热带病与寄生虫学，2005，3（1）：37-42.

［2］张丽娟，张景山，付秀萍，等.广东连平县存在新的蜱传斑点热立克次体［J］.中国人兽共患病学报，2006，22（8）：697-700.

［3］邓国藩，姜在阶.中国经济昆虫志·第39册·蜱螨亚纲·硬蜱科［M］.北京：科学出版社，1991：43-349.

［4］Clare A.Anstead，Neil B.Chilton.A Novel Rickettsia Species Detected in Vole Ticks（Ixodes angustus）from Western Canada［J］. Applied and Environmental Microbiology，2013，97（24）：7583-7589.

［5］孙响，张桂林，刘然，等.新疆地区Rickettsia raoultii分子流行病学研究［J］.中华流行病学杂志，2013，34（7）：756-757.

［6］赵高余.中国新疆地区蜱种立克次体的研究［D］.北京：中国疾病控制中心，2013.

［7］Cao W C，Zhan L，De Vlas S J，et al.Molecular detection of spotted fever group rickettsia in Dermacentor silvarum from a forest area ofnortheastern China［J］.J Med Entomol，2008，45（4）：741-744.

［8］Stanislav Shpynov，Pierre-Edouard Fournier，Nikolay Rudakov，et al.Detection of a Rickettsia Closely Related to Rickettsia aeschlimannii，“Rickettsia heilongjiangensis，”Rickettsia sp.Strain RpA4，and Ehrlichia muris in Ticks Collected in Russia and Kazakhstan［J］. Journal of Clinical Microbiology，2004，42（5）：2221-2223.

［9］Philippe Parola，Christopher D.Paddock，Cristina Socolovschi，et al. Update on Tick-Borne Rickettsioses around the World：a Geographic Approach［J］.Journal of Clinical Microbiology（JCM），2013，26（4）：657-702.

［10］马鸣，克德尔汗·巴亚恒，李飞，等.新疆艾比湖湿地自然保护区鸟类清单及秋季迁徙数量统计［J］.四川动物，2010，29（6）：912-918.

Molecular epidemiological study of thespotted fever group Rickettsia in free-living ticks in thewetlands of Aibi Lake，China-Kazakhstan border

XU Jun1，WANG An-dong2，LUO Dan3，XU Xin-long4，DAI Li4，YANG Jie4，XU Jian-jun5，REYihanguli5，SANiyeguli5，WANG Li-na2，DU Jing-yun3，LI Zhi-yuan2，WANG Yuan-zhi3
（1.Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Authority of the PRC，Urumqi 830000，China；2.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezhi 832000，China；3.College of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832000，China；4.Alashankou Entry-Exit Inspection and Quarantine Authority of the PRC，Alashankou 833418，China；5.College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

To investigate the prevalence of tick-borne spotted fever group Rickettsia（SFGR）in the wetlands of Aibi Lake，China-Kazakhstan border and to provide a scientific basis for the prevention and control of tick-borne SFGR.The OmpA gene ampliflcation was carried out for DNA samples extracted from Hyalomma asiaticum，Dermacentor marginatus，and Rhipicephalus sanguineus collected in the wetlands of Aibi Lake，China-Kazakhstan border and the positive samples were subjected to sequencing and sequence analysis to establish the molecular phylogenetic tree.56（36.84%）of the 152 DNA samples were positive for SFGR. The phylogenetic analysis based on nucleotide sequence showed that all detected SFGR strains were clustered together with（accessionnumbers：JQ798904）；These strains had the highest homology with Rickettsia raoultii（99.02%）.Tick-borne SFGR is prevalent in the wetlands of Aibi Lake on China-Kazakhstan border.Preventive measures should be taken in time to protect humans and animals from this disease.

Spotted Fever Rickettsia；free ticks；ompA gene；Molecular epidemiological；Aibi Lake；Ala-shankou Port；China-Kazakhstan border种立克次体［1-2］。新疆地域辽阔，生境多样，蜱种丰富，但对其立克次体研究报道相对较少。本研究利用分子生物学方法，对新疆艾比湖湿地游离蜱斑点热立克次体进行核酸检测和序列分析。

R 384.4

A

0529-6005（2016）08-0018-02

2015-11-05

新疆维吾尔自治区自然科学基金（201442137-1）；国家质检总局科技计划项目（2014IK239）；公益性行业（农业）科研专项（201103008）

徐军（1969-），男，高级兽医师，硕士，从事动物检验工作，E-mail：alskxj@sina.com

王安东（1990-），男，硕士生，研究方向为兽医卫生监督与管理，E-mail：wadshzu@163.com

注：王安东与徐军对本文具有同等贡献