环丙沙星和盐酸林可霉素对猪链球菌体外联合抑菌试验

吴海港，叶兆伟，张广强

（信阳农林学院，河南信阳464000）

环丙沙星和盐酸林可霉素对猪链球菌体外联合抑菌试验

吴海港，叶兆伟，张广强

（信阳农林学院，河南信阳464000）

为了观察环丙沙星和盐酸林可霉素联合用药产生作用，采用环丙沙星和盐酸林可霉素体外抑菌试验，试验菌株为临床上分离的猪链球菌17株，采用微量稀释法检测两种药物对猪链球菌的最小抑菌浓度（MIC），依据最小抑菌浓度再采用棋盘稀释法及时间-杀菌曲线判断联合药敏效果。结果显示，在17株猪链球菌对两种药物联合药敏试验中呈协同作用的占64.71%，相加作用的占23.53%，无关作用的占11.76%，无拮抗作用，联合药敏试验中对猪链球菌的平均部分抑菌指数（FIC）为0.54，说明环丙沙星和盐酸林可霉素联合用药具有较好的协同作用。

环丙沙星；林可霉素；联合用药；猪链球菌

环丙沙星和盐酸林可霉素是临床上应用最多的抗菌药物之一，临床主要用于治疗呼吸道及相关细菌感染性疾病。但是随着畜牧业规模化、集约化发展，药物的大量使用，甚至滥用已造成大量的耐药菌株，环丙沙星和盐酸林可霉素的临床抗菌作用已有所下降，为延缓环丙沙星和盐酸林可霉素耐药菌株的产生，提高环丙沙星及林可霉素的用药安全性及抗菌活性等，寻求新的联合用药技术，增加疗效，抑制耐药菌株的产生。为此，本试验选用棋盘稀释法测定环丙沙星和林可霉素联合用药对猪链球菌的体外抑菌效果，以期探讨环丙沙星和林可霉素是否具有增效作用，为兽医临床疾病的控制打开新的途径。

1材料与方法

1.1药品环丙沙星原料（含量99.5%，由河南自然康动物药业有限公司提供，批号：H010105）；盐酸林可霉素原料（含量99.0%，由河南自然康动物药业有限公司提供，批号：H0080306）；试验前精密称取各药，无菌操作配制成所需浓度的药液，分装后置-20℃冰箱保存备用。

1.2试验菌株猪链球菌17株（由信阳动物疫病监测中心提供，系临床分离致病菌）。质控标准参考菌为链球菌药敏质控株CVCC3223，购自中国兽医药品监察所。

1.3培养基5%犊牛血清的营养肉汤、鲜血营养琼脂培养基按照常规方法制作，用于猪链球菌培养。

1.4试验方法

1.4.1菌液的制备试验前将菌种经培养、复壮、重新分离同一平板上性状相似的2～3个菌落，接种到3～5mL肉汤培养基内，于37℃培养8～10 h。

为确定茵液浓度，对细菌分别作平板活菌计数：将原菌液以10-1倍稀释，分别如下：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8；将各菌液分别取10-6、10-7、10-8的浓度以微量加样器取100 μL到预先准备好的鲜血营养琼脂平板中，将玻璃刮铲在火焰上灼烧灭菌冷却后，将菌液均匀推散在平板培养基表面（经无菌检查合格），每个浓度涂3个平板；培养24 h后观察，计算菌落数。

1.4.2单药最小抑菌浓度（MIC）测定方法采用12×8的96孔V型孔底的微孔稀释板，每排的1～12孔各加入50 μL 5%犊牛血清的营养肉汤，再取50 μL 4倍终浓度的药液从第1孔做倍比稀释至11孔，稀释完第11孔后弃去50 μL，12孔为无药对照。再加50 μL稀释好的菌液于每排的1～12孔，使最终每孔菌液浓度为1×105CFU/mL，37℃孵育18～24 h后观察结果。试验时每种药物对每种菌做3排重复，同时以标准菌CVCC3223做质量控制。

1.4.3联合药敏试验采用棋盘微量稀释法以各药对应各种菌MIC值确定药物稀释度，采用7个稀释度，药物最高浓度为其MIC的2倍，依次对倍稀释为1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍浓度，两种药物的稀释分别在96孔板上按横列和纵列进行联合，接种菌量为1×105CFU/mL，37℃孵育18～24 h后观察结果。

1.5结果判定以FIC作为联合药敏试验的判定依据。

FIC指数的计算公式：

（FIC：≤0.5协同作用；0.5～1相加作用；1～2无关作用；＞2拮抗作用）。

1.6体外药效动力学评价选取17株链球菌中的13-5株为试验菌株，测定环丙沙星和盐酸林可霉素单用及联合用药（1∶1）的时间-杀菌曲线。环丙沙星和盐酸林可霉素单药取1MIC浓度，联合用药取最佳抑菌点浓度，对照管不含药物，分别将菌液和药液混合，使菌液终浓度为1×105CFU/mL，37℃培养，分别于0、1、2、4、.6、8、10、12 h取0.1 mL培养液进行活菌计数，绘制时间-杀菌曲线。

2结果

2.1环丙沙星和盐酸林可霉素单用体外药敏试验结果环丙沙星和盐酸林可霉素单用及联合用药的体外药敏试验结果见表1，从表1可以看出，单用环丙沙星对猪链球菌的MIC值为8～256 μg/mL，盐酸林可霉素单用时对猪链球菌的MIC值为16～256 μg/mL。

2.2环丙沙星和盐酸林可霉素联合药敏试验结果环丙沙星与盐酸林可霉素联合药敏试验结果由表1可以看出，17株菌中有11株呈协同作用，所占比例64.71%；4株为相加作用占23.53%；2株为无关作用占11.76%；无拮抗作用。环丙沙星与盐酸林可霉素联用对猪链球菌FIC的平均值分别为0.54，具有较好的协同作用。

表1环丙沙星和林可霉素单用及联合应用药敏试验

表2两药联用对猪链球菌FIC构成比

2.3时间-杀菌曲线测定结果环丙沙星和盐酸林可霉素单用及联合用药对猪链球菌13～5的时间-杀菌曲线见图1，从图1可以看出，在1 h时，环丙沙星组、盐酸林可霉素组及联合用药组都出现菌数下降趋势，但差异不大。从4 h开始，盐酸林可霉素组菌数开始出现上升趋势。在10 h时环丙沙星和盐酸林可霉素的菌数差异不显著，但低于对照组，减少约103倍，而联合用药组和对照组相比减少约105倍。在12 h时，和对照组相比，环丙沙星减少约103倍，盐酸林可霉素减少约102倍，而联合用药组减少约106倍，可见两药合用有较好的协同作用。

图1环丙沙星和盐酸林可霉素单用及联合对猪链球菌的时间-杀菌曲线

3讨论

环丙沙星是第3代喹诺酮类抗生素，是一种广谱的抗生素，其作用机理主要是抑制细菌的DNA回旋酶而发挥快速杀菌作用。盐酸林可霉素对常见革兰阳性菌有较强抗菌活性。可作为耐青霉素、红霉素替代药物，其作用机制主要是作用于核糖体的50S亚基，阻止肽链的延长，从而抑制细菌细胞的蛋白质合成［1］。体外药敏试验发现猪链球菌对环丙沙星的MIC值为8～256 μg/ mL，对盐酸林可霉素的MIC值为16～256 μg/mL，与文献报道MIC值相比［2-4］，猪链球菌对环丙沙星和林可霉素表现出一定的耐药性，往往临床治疗猪链球菌病时效果不佳，造成养殖过程中用药剂量加大，易导致食品动物中的药物残留。

环丙沙星和盐酸林可霉素体外药敏试验及时间-杀菌曲线表明，两者连用对猪链球菌具有协同或相加作用，其协同增效机制可能是通过不同途径阻断细菌蛋白质的合成，起到抑菌和杀菌的作用，试验结果表明，两者合用可提高疗效、减少耐药发生和降低毒副反应，因此临床中治疗由猪链球菌引起的感染，可以采用环丙沙星和盐酸林可霉素联合用药，可有效杀灭细菌同时减缓耐药的发生。但是由于两种抗生素联合使用对某些或某一种细菌起到协同或相加作用，并不是对所有的细菌均能起到增效作用［5-6］，因此在临床使用中不能随意将两种抗生素进行联合用药，具体应用情况还要以实验室结果为依据。

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S858.28

B

0529-6005（2016）08-0108-02

2015-03-02

信阳市科学计划项目（140052）

吴海港（1982-），男，讲师，硕士，主要从事兽医药理学研究及教学，E-mail：haigang413@126.com