鸽源鼠伤寒沙门菌分离鉴定及药敏试验

程旭，沈欣悦，刘梅，李建梅，姜逸，赵宝华，戴亚斌

（中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州225125）

鸽源鼠伤寒沙门菌分离鉴定及药敏试验

程旭，沈欣悦，刘梅，李建梅，姜逸，赵宝华，戴亚斌

（中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州225125）

从江苏省某肉鸽场发生的腹泻症状的死亡鸽中采集病料，分离出1株病原菌，通过PCR鉴定菌株，并进一步做药敏试验。结果表明，病原菌分离鉴定为鼠伤寒沙门菌，属于血清O4群，该菌对20种抗生素均敏感。

鼠伤寒沙门菌；分离；鉴定；药敏试验

鼠伤寒沙门菌是一群非适应性或泛嗜性的沙门菌，具有广泛的宿主，是目前世界各国分离率最高的菌型之一。该菌能引起各种家禽和哺乳动物的传染病，也可引起人类感染，具有重要的公共卫生意义。

由鼠伤寒沙门菌引起的鸽沙门菌病又称鸽副伤寒，是鸽子常见的细菌性疾病，也是引起鸽子死亡的主要危害病之一。该病既可水平传播，也可垂直传播，病鸽和带菌鸽是本病的主要传染源。该病的发生无明显季节性，各种日龄鸽均可感染发病，但以年老体弱鸽只较为易发，病鸽主要表现下痢、关节炎、运动神经功能障碍等症状。特别是与其他疾病合并感染暴发，往往给养鸽业造成巨大经济损失［1］。抗生素对致病菌是非常有效的治疗手段，但近年来抗生素的广泛应用使许多致病菌包括沙门菌产生了耐药性。随着时间的推移，耐药性不断增强，并且耐药谱不断扩增，从而增加了对沙门菌感染治疗的难度。因此，合理选择抗生素治疗沙门菌病对于疾病的康复和控制耐药性的不断增强具有重要意义［2］。本作者在发生腹泻症状的鸽群中分离并鉴定了一株鼠伤寒沙门菌，并测定了该菌的耐药情况，为临床用药及本病控制提供理论依据。

1材料与方法

1.1主要试剂普通营养肉汤粉、麦康凯琼脂为上海博微公司产品；Taq PCR Master Mix、100 bp DNA ladder为百泰克公司产品；沙门菌属诊断血清为宁波天润生物药业有限公司产品；药敏试纸为英国OXOID公司产品。

1.2细菌分离取病死鸽肝脏、脾脏、小肠，加PBS碾磨后，取上清接种麦康凯平板，均匀涂板后倒置于37℃恒温培养箱中培养18 h。

1.3细菌鉴定普通营养肉汤培养基参考文献［3］制备，取平板中单个菌落在肉汤培养基中摇菌培养12 h后，收集1 mL菌液，4℃3 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS重悬细菌。将该菌在沸水中煮5 min以裂解菌体，分离DNA用于PCR鉴定。

根据GenBank中鼠伤寒沙门菌的16S rRNA基因序列设计1对引物，P1：5′-GCGTCAGATTAGTTAGTTGG-3′；P2：5′-ACCGCTTGTGCGGGCCCG-3′。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。预期扩增目的片段大小为400 bp。

PCR扩增条件94℃预变性5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30个循环，72℃延伸10 min。1.4血清型鉴定根据沙门菌属诊断血清说明书，在干净玻片上滴1滴血清，取少量被检菌苔与血清混匀，轻轻摇动玻片，1 min内肉眼判断结果，以生理盐水作阴性对照。出现凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性。

1.5药敏试验药敏试验采用K-B纸片扩散法进行。将分离菌接种于普通营养肉汤中，37℃摇振培养18 h。吸取一定比例稀释后的菌液均匀涂抹于普通营养琼脂，将药敏试纸均匀粘贴在平板上，在37℃恒温培养箱中倒置培养16 h，测量抑菌圈大小，按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的标准［4］判定结果。

2结果与分析

2.1细菌分离培养16 h可见直径大约1 mm的隆起菌落，圆形、表面光滑、边缘整齐灰白色菌落。取单个菌落革兰染色，可见染成红色的革兰阴性短杆菌。

2.2细菌鉴定分离细菌摇菌培养后经PCR扩增，取PCR产物10 μL于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，。结果可见在约400 bp处见到一特异、明显条带（图1），与预期结果相符。将扩增PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果与GenBank中鼠伤寒沙门菌基因组核苷酸序列同源性达100%，证实该分离菌为鼠伤寒沙门菌。

图1分离菌基因组的PCR扩增

2.3血清型鉴定根据沙门菌属诊断血清说明书操作流程，该鼠伤寒沙门菌与O4单因子血清混匀后，可见明显絮状凝集现象，肉眼观察与阴性对照区别明显，因此该鼠伤寒沙门菌为O4血清型。

2.4药敏试验分析采用21种常规抗生素药敏纸片进行药敏试验，结果显示，该株鼠伤寒沙门菌对20种药物均敏感，只有链霉素呈现中介（表1）。

3讨论

肉鸽养殖作为广泛的特种经济养殖项目，具有较高的经济效益，一旦发生疫病损失也较为惨重。鸽沙门菌病就是其中一种影响较大的疫病。沙门菌可以水平传播，也可以通过患鸽或带菌的亲鸽哺乳行为垂直传播，这给该病的防治带来一定的难度。目前还没有可行的疫苗进行免疫，抗生素作为首选预防和治疗鸽沙门菌病被广泛运用，但是在抑制杀灭有害菌的同时，也会抑制一些有益菌，从而导致菌群失调，机体抵抗力下降诱发其他疫病。因此根据药敏试验进行药物的选择对于有效的治疗鸽沙门菌病及防止耐药性的产生具有重要意义。

作者在一起幼鸽呼吸道症状伴有腹泻的鸽场中分离获得1株细菌，经PCR鉴定后为鼠伤寒沙门菌，血清型鉴定该鼠沙门菌属于O4血清群。9类21种常用抗生素进行药敏试验显示，该菌株对20种抗生素均敏感，只对链霉素为中介，这与该鸽场较少使用抗生素的情况相符。根据药敏试验结果，选用喹诺酮类抗生素治疗后，全群状况转好，幼鸽死亡率降低。

在目前集约化的养殖情况下，防止鸽沙门菌病的发生，应该做到管理带动预防的措施。采用科学的检测方法进行检疫，掌握饲养场沙门菌流行情况，严格遵守卫生防疫措施，按照净化方案进行检疫和淘汰，控制和消灭传染源，防止和减轻沙门菌对种鸽的危害。

表1分离菌株耐药性结果

［1］周宏赞，张文.肉鸽沙门菌病［J］.中国兽医杂志，2000，36（1）：36.

［2］况彗星，韦婷.禽沙门菌的检测与防制［J］.中国家禽，2003，04：1-4.

［3］俞树荣.微生物学和微生物学检验［M］.北京：人民卫生出版社，2002：169-175.

［4］Nccls.孙长贵，译.Nccls抗微生物药物敏感性试验执行标准［DB/OL］.2009.

S836

B

0529-6005（2016）08-0099-02

2015-04-27

公益性行业（农业）科研专项（201303044）；江苏省科技支撑计划（BE2014363）；扬州市自然科学基金面上项目（YZ2015103）

程旭（1983-），男，助理研究员，硕士，主要从事禽病研究，E-mail：peterchengxu@126.com

戴亚斌，E-mail：ybdai@163.com