4种ELISA试剂盒检测禽白血病病毒效率比较

杨永立，王培坤，邹广珍，吴科敏，焦鹏涛，韦平

（广西大学养禽与禽病学研究所，广西南宁530004）

4种ELISA试剂盒检测禽白血病病毒效率比较

杨永立，王培坤，邹广珍，吴科敏，焦鹏涛，韦平

（广西大学养禽与禽病学研究所，广西南宁530004）

对采集鸡蛋清、泄殖腔肛拭子以及蛋清或泄殖腔肛拭子检测阳性的鸡只之血清接种DF-1细胞的上清液，分别采用A、B、C、D 4种ELISA试剂盒进行ALV-P27抗原的3次试验检测。结果显示，A试剂盒的蛋清和病毒分离的敏感度最高，B试剂盒对肛拭敏感性最高。A试剂盒的3次试验检测的符合率都在87%以上，并且较稳定，结果可信度高；C试剂盒的符合率在79%以上，相对稳定；B和D试剂盒的符合率都不稳定。

禽白血病病毒；酶联免疫吸附试验；蛋清；泄殖腔棉拭子；病毒分离

禽白血病（avian leukosis，AL）是禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）和禽肉瘤病病毒（avian sarcoma virus，ASV）群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。当前，主要是采用在种鸡场进行规模化的检测，淘汰阳性鸡群的净化方式，而ELISA检测方法是一种特异性好、灵敏度和效率比较高并且方法简便、容易操作的检测方法［1-2］，可在规模化养殖场中推广。

本研究对从广西规模化禽养殖场采集的鸡蛋清92份、泄殖腔肛拭子92份，以及蛋清或泄殖腔肛拭子检测为阳性的鸡只抽取血清进行病毒分离收集的上清液92份，共3批样品，分别用国内外四家公司研发的ELISA试剂盒进行ELISA ALV-P27抗原检测。通过比较它们对不同样品的敏感性，检测结果的符合率及符合率的稳定性，筛选出检测效率比较高的试剂盒，以便开展禽白血病净化的养殖场准确选择试剂盒，保证净化鸡场的ALV净化质量。

1材料与方法

1.1试验材料蛋清、泄殖腔肛拭子、血清样品采集于广西某鸡场；DF-1细胞系本实验室传代保存；ELISA检测试剂盒分别来自国内外4家不同的公司，其中A试剂盒来自IDEXX公司；B、C、D试剂盒来自国内公司；分别命名为A、B、C、D，4种试剂盒都在有效期内，。

1.2样品处理

1.2.1蛋清、泄殖腔肛拭子处理无菌采集的蛋清样品，在检测前冻融3次，待测。无菌棉棒采集的泄殖腔肛拭子加到检测试剂盒配备的稀释液中，-80℃冷冻保存，检测前冻融3次待测。

1.2.2血清处理无菌抽取的血液样品分离血清。复苏实验室液氮冻存的DF-1细胞，经放大培养传代至4个24孔板，放置37℃、5%CO2培养箱内培养，待细胞对数生长期接种分离的血清，第3天换液，第9天收集上清液，冻融3次待测。

1.3ELISA检测对收集蛋清、泄殖腔肛拭子、上清液，用A、B、C、D 4种试剂盒按照试剂盒的使用说明书进行检测。

2实验结果

2.14种试剂盒对蛋清ALV-P27检测结果采集广西某养鸡场33周龄母鸡的蛋清样品92份，蛋清冻融3次后每份分成4份。分别使用A、B、C、D试剂盒，按照使用说明书进行检测，检测结果如表1。

表14种试剂盒对蛋清ALV-P27检测结果

如表1所示，试剂盒A、B同时检测出7份阳性，检出率最高，D试剂盒检测率最低；阳性符合率方面，A试剂盒的平均符合率最高，为95.24%。

2.24种试剂盒对泄殖腔肛拭子ALV-P27检测结果采集广西某养鸡场110日龄鸡的肛拭子样品共92份，分别使用A、B、C、D试剂盒，按照使用说明书进行检测。检测结果如表2。

表24种试剂盒对泄殖腔肛拭子ALV-P27的检测结果

如表2所示，试剂盒B检测阳性率最高，为98.91%，D试剂盒阳性检出率最低只有40.22%；在阳性符合率上，A试剂盒的平均阳性符合率为96.28%，B试剂盒的为100%，C试剂盒的为93.08%，D试剂盒的最低为43.78%。

2.34种试剂盒病毒分离ALV-P27检测结果采集广西某养鸡场110日龄鸡的血清样品共92份，按照经典病毒分离方法进行病毒扩大培养；收集上清后使用A、B、C、D试剂盒，按照使用说明书进行检测。检测结果如表3。

表34种试剂盒病毒分离ALV-P27检测结果

如表3所示，试剂盒A检测阳性率最高为18.49%，试剂盒C、D检测阳性率相同都为14.13%，而B试剂盒检测阳性率最低为7.61%。4个试剂盒的平均阳性符合率分别为：87.54%、39.97%、82.27%、73.59%。

2.4A、B、C、D 4种试剂盒符合率的比较比较A、B、C、D 4种试剂盒检测符合率的稳定性，如图1所示，A试剂盒3次试验中检测符合率都维持在一个稳定的水平；其次是C试剂盒；B、D试剂盒的3次检测结果都有较大差异，稳定性很低。

图14种试剂盒在3次试验检测中的稳定性比较

3讨论

目前，禽白血病在我国感染严重，我国大多数省份的禽养殖场中都存在ALV的感染［3-4］。对鸡场开展禽白血病净化，培育无ALV感染的种鸡群对我国的禽养殖业的发展来说是刻不容缓的。ELISA、PCR、RT-PCR、RT-qPCR、IFA是常用的ALV检测方法［5-6］，养殖场净化主要是采用对原种鸡群开展外源性病毒的净化方法，通过多次的抗原、抗体检测，了解该原种群的流行亚群并淘汰阳性个体。因此能快速、准确的在大规模化养殖场中对ALV进行检测、操作方法简单、对试验人员技术和实验条件要求相对不高的ELISA检测方法是相对其他检测方法较合适的选择［7］。

本研究是用国内外4种不同的ELISA试剂盒分别对采集的鸡的蛋清、泄殖腔肛拭子，以及蛋清或泄殖腔肛拭子检测为阳性的鸡只抽取血清进行病毒分离，进行ALV-P27抗原检测。从3次的试验结果中可以看出，A、B试剂盒对蛋清的敏感度最高；B试剂盒对肛拭子敏感性最高；A试剂盒的病毒分离检测结果敏感性最高。从阳性检出率来看，A和B试剂盒的敏感性相对较好。从3次试验的检测符合率来看，A试剂盒的平均符合率是最高的，并且都维持在一个稳定的水平，B试剂盒的符合率在第一、第二两次检测中都较高，但第3次的符合率极低，不稳定，C试剂盒的符合率不高，但都维持在一个稳定的水平，D试剂盒的符合率最低，且不稳定。检测结果显示，从试剂盒针对不同样品的检出率来看，A试剂盒适用于蛋清和病毒分离的检测，B试剂盒适用于蛋清和泄殖腔肛拭子样品的检测。综合检出率以及阳性样品的符合率来看，A试剂盒是最好的选择，B和C试剂盒次之，D试剂盒的检测效率和检测特性有待研究。

通过本次研究试验的对比可以看出，选择不同的ELISA检测试剂盒、不同的样品，ALV的检出情况是有很大差异的，可能是检测试剂盒的特异性差异或是在检测过程中存在的其他影响因素，同时样品种类的选择也会影响ALV的检出。本试验研究的目的是通过对比几种试剂盒的检测效率，希望在规模化种禽场净化过程中，要根据样品的种类来选择敏感性、特异性及符合率高且稳定的试剂盒，同时对检测结果有疑问的有必要采用ALV的其他检测方法，如IFA、PCR进行综合试验，以保证检测结果的质量［8-9］。在禽白血病的净化过程中除了检测样品的和试剂盒的选择外，还有比如鸡检测日龄、检测指标、环境和生物安全的控制、管理和检测技术的水平都会对禽白血病净化产生重要影响，因此，我们应该把对禽白血病净化产生影响的因素和影响因子降到最低，以达到更好的净化效果。

［1］叶建强，秦爱建，邵红霞，等.J亚群禽白血病病毒（ALV-J）ELISA检测方法的建立［J］.中国兽医学报，2006（03）：235-237.

［2］张胜斌，吴天威，韦平，等.地方优良鸡种禽白血病病毒感染调查及净化［J］.中国家禽，2010（12）：11-16.

［3］王培坤，秦丽莉，毕玉彧，等.广西麻鸡感染A亚群与J亚群禽白血病病毒的诊断［J］.中国家禽，2015（05）：56-58.

［4］张志，崔治中，赵宏坤，等.商品代肉鸡J亚群禽白血病的病理及病毒分离鉴定［J］.中国兽医杂志，2002，38（6）：6-8.

［5］奚德华，梁有志，尹丽萍，等.规模化种禽场禽白血病检测方法的比较及初步应用［J］.中国家禽，2014（03）：14-17.

［6］庄金秋，梅建国，沈旭，等.禽白血病病毒实验室检测方法研究进展［J］.家禽科学，2012（11）：45-51.

［7］Yun B，Li D，Zhu H，et al.Development of an antigen-capture ELISA for the detection of avian leukosis virus p27 antigen［J］. Journal of Virological Methods，2013，187（2）：278-283.

［8］王鑫，崔治中，龚建森，等.ELISA与IFA用于检测J亚型禽白血病病毒的比较分析［J］.畜牧兽医学报，2013，44（09）：1499-1503.

［9］杨飞跃，吴艳，黄翌，等.禽白血病p27抗原检测阳性与病毒分离的相关性比较［J］.中国兽医杂志，2012，48（5）：26-29.

Thecomparison of detection results of ALV with four ELISA kits

YANG Yong-li，WANG Pei-kun，ZOU Guang-zhen，WU Ke-min，JIAO Peng-tao，WEI Ping
（Institute for Poultry and Health，Guangxi University，Nanning 533033，China）

Four kinds of A，B，C and D commercial ELISA kits were used to detect the ALV-P27 antigen of different samples，albumin samples，cloacal swabs and the DF1 cell supernatants.The results indicated that A ELISA kits was the most sensitive to albumin samples and virus isolation，and B ELISA kit was the most sensitive to cloacal swabs.The A ELISA kit had the highest and most stable coincidence Rate，and the consistent of detection rate in every test were 87%，which are more sensitive and precise than B，C and D.

ALV；ELISA；albumin samples；cloacal swabs；virus isolation

WEI Ping

S852.65+9.3

A

0529-6005（2016）08-0095-03

2015-09-09

国家公益性（农业）行业科研专项（201203055）；国家现代农业产业技术体系广西肉鸡产业创新团队建设项目（nycytxgxcxtd-04-20-2）

杨永立（1992-），女，硕士生，主要从事禽病学研究，E-mail：1184397684@qq.com

韦平，E-mail：pingwei8@126.com