长白山梅花鹿鹿茸干细胞S100A4基因克隆及原核表达

张宇航，郝景锋，薛会明，刘健博，兰文峰，李心慰，刘国文

（1.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林吉林132000；2.吉林大学动物医学学院，吉林长春130062）

长白山梅花鹿鹿茸干细胞S100A4基因克隆及原核表达

张宇航1，郝景锋1，薛会明1，刘健博1，兰文峰1，李心慰2，刘国文2

（1.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林吉林132000；2.吉林大学动物医学学院，吉林长春130062）

为了研究S100A4蛋白在鹿茸发生过程中的生物学功能，构建长白山梅花鹿鹿茸S100A4基因原核表达载体，并进行BL21原核表达；自鹿茸骨膜中提取总RNA，逆转录成cDNA，以特异性引物扩增S100A4，扩增产物克隆到pMD18-T载体并测序鉴定，将目的片段和原核表达质粒pET-15b分别用BamH I和HindⅢ双酶切并连接，再将重组质粒转入BL21用TPIG进行诱导表达；结果通过序列的对比分析，S100A4基因是一个相对保守的基因，与多个物种的匹配度达到90%，与牛S100A4基因同源性最高，达到98.4%；成功构建了pET15b-S100A4表达质粒，转化BL21诱导表达后，SDSPAGE电泳检测显示表达的蛋白分子量为11 kD，与预期一致。表明梅花鹿鹿茸干细胞S100A4基因的可以在原核中克隆、分析和表达，为真核表达和进一步的蛋白功能分析奠定了基础。

梅花鹿；S100A4基因；克隆；原核表达

S100蛋白家族是一类EF-手型钙结合蛋白，是一类广泛存在的钙调蛋白，通过钙离子信号传导途径参与细胞分裂、分化、肿瘤生长以及细胞外基质分泌活动等过程［1］。S100A4蛋白是由101个氨基酸组成的多肽，在多种肿瘤细胞中高表达，而且恶性肿瘤中比良性肿瘤中表达更高，在正常成年器官和组织中不表达，目前的研究确定S100A4蛋白是一个与恶性肿瘤密切相关的因子［2］。

鹿茸是一个良好的生物医学模型，雄性梅花鹿头部生茸区骨膜细胞（AP细胞）每年周期性形成角柄，AP细胞中S100A4蛋白呈现高表达，而AP细胞分化成角柄骨膜细胞（PP细胞）进而快速形成鹿茸过程中，PP组织及PP细胞都不表达S100A4基因，也检测不到S100A4蛋白，表明S100A4蛋白主要参与角柄形成过程，而且经历了从高表达到不表达的转变，但其生物学功能及调控机制目前还不清楚［3-4］。本试验拟扩增梅花鹿S100A4基因序列，并克隆到pET-15b质粒中，利用大肠埃希菌BL21进行表达，为研究S100A4蛋白在鹿茸生长过程中的作用机制奠定基础，为肿瘤发生机制的研究提供思路。

1材料与方法

1.1材料RNA提取、反转录及PCR试剂、限制性内切酶（BamH I，HindⅢ）、T4 DNA连接酶、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司；pMD18-T载体、pET-15b载体（Clontech公司）；LB培养基自制；BL21菌株、DH5-α菌株为本实验室保存。

1.2方法

1.2.1S100A4基因的扩增、鉴定采集雄性梅花鹿AP组织，液氮冷冻，研磨，用总RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录成cDNA，根据牛S100A4的cDNA序列（GenBank：D89056.1）设计引物，序列如下：F：5′-TACTCGGGCAAGGAGGG-3′，R：5′-GCCAGGGTGAGCTGATG-3′，预测片段长度：330 bp，电泳后切胶，以试剂盒回收330左右的目的片段，回收产物连接于pMD18-T载体，转化DH5-α，测序鉴定。

1.2.2序列分析用DNAman软件及GenBank在线Blast工具对克隆的梅花鹿S100A4序列进行分析，并与GenBank中已登录的牛、犬、猪、羊、鼠、人基因进行同源性比较。

1.2.3载体构建、转化及原核表达将克隆质粒pMD18-S100A4，及pET-15b载体分别用BamH I、HindⅢ双酶切，分别回收纯化后以T4连接酶4℃过夜连接，构建pET15b-S100A4质粒，转化大肠埃希菌BL21，涂布于琼脂平板（含Kan 30 μg/mL），37℃倒置培养18 h，挑取单个菌落接种于LB液体培养基，扩大培养后提取质粒用BamH I、HindⅢ双酶切鉴定。将酶切鉴定正确的pET15b-S100A4转化BL21，菌液加入100倍体积的LB液体培养基（含Kan 30 μg/mL），振荡培养至吸光度（A）值0.4～0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续振荡培养6 h，试验设pET-15b空质粒诱导对照和BL21诱导对照，收集菌液提取总蛋白，SDSPAGE电泳检测表达产物。

2结果

2.1梅花鹿S100A4基因的扩增、测序及同源性分析以梅花鹿AP细胞DNA为模板，经PCR扩增得到330 bp清晰条带，如图1，与预期基本一致。回收后连接于pMD18-T载体，转化DH5-α，测序鉴定后利用DNAman软件分析发现与人、牛、羊、鼠、犬、猪同源性分别达到91.3%、98.4%、 92.5%、85.6%、88.6%、95.2%。

图1S100A4基因扩增结果

2.2载体构建结果以BamH I、HindⅢ双酶切pMD18-S100A4，得到约330 bp的片段，以相同内切酶处理pET-15b质粒，再将330 bp的片段与其连接，得到pET15b-S100A4。酶切鉴定如图2。

2.3原核表达结果pET15b-S100A4转化BL21感受态细胞中，经IPTG诱导后蛋白表达量超过30%，SDS-PAGE电泳检测显示蛋白分子质量为11 kD，与预期基本一致，如图3。

图2重组质粒酶切鉴定

图3S100A4基因表达产物的检测

3讨论

鹿茸每年可进行周期性再生，生茸区骨膜AP组织和细胞中都有S100A4蛋白的表达，而每年的基础角柄骨膜PP组织和细胞中都检测不到S100A4蛋白，表明鹿茸形成过程中S100A4蛋白经历了一个从表达到不表达的转变。本试验克隆了长白山梅花鹿的S100A4基因，通过DNAman软件及在线Blast发现，该基因与牛、猪、人的S100A4基因具有非常高的重合度，说明这是一个非常保守的基因，鉴于S100A4在癌变组织中也呈现高表达，现阶段研究S100A4蛋白对鹿茸生长的影响及调控机制，对揭示器官快速生长与癌变的关系，对肿瘤的预防和治疗有着重要的意义，以鹿茸作为模型研究癌变是一全新思路，而S100A4的生物学功能是建立这一生物模型的关键。

S100A4基因从表达到沉默的机制目前尚不清楚，其生物学功能在肿瘤研究领域初现端倪，Fernandez等研究发现，S100A4蛋白过度表达，会使细胞周期失去控制，促进肿瘤的发生［5］；Sherbet G V等研究发现，S100A4蛋白可以和细胞骨架发生作用，增强细胞的变形能力，从而增加肿瘤细胞的活动能力［6-7］；Ambartsumian N等在试验中发现S100A4蛋白可以作为血管生成因子对血管形成直接起作用，而在肿瘤生长和转移的过程中，血管发生是关键环节［8-9］。在鹿茸生长发育特别是角柄形成过程中，AP细胞快速增殖阶段，大量表达的S100A4蛋白是否也与细胞转移或血管形成有关尚待证实，在角柄形成以后，PP细胞形成鹿茸阶段，同样需要细胞转移和血管生成，但S100A4在这一时期却没有表达，所以对S100A4的研究才刚刚开始，本试验构建了S100A4基因的原核表达载体并在BL21中表达，为研究该蛋白在鹿茸生长中的作用奠定了基础。

［1］王大涛，赵海平，褚文辉，等.梅花鹿S100A4基因的克隆及融合蛋白的表达［J］.兽类学报，2011，31（1）：103-107.

［2］张英，李莉，郝琳琳，等.梅花鹿S100A4基因的克隆及原核表达［J］.中国病原生物学杂志，2013，8（3）：242-244.

［3］刘东.梅花鹿鹿茸干细胞S100A4融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化［D］.镇江：江苏科技大学，2011.

［4］魏明立，褚文辉，赵海平，等.梅花鹿S100A4基因RNAi重组慢病毒载体的构建［J］.兽类学报，2012，32（4）：335-339.

［5］Fernandez-Fernandez M R，Veprintsev D B，Fersht A R.Proteins of the S100 family regulate the oligomerization of p53 tumor suppressor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：4735-4740.

［6］Sherbet G V，Lakshmi M S.S100A4（MTS1）calcium binding protein in cancer growth，invasion and metastasis［J］.Anticancer Res，1998，8（4A）：2415-2421.

［7］Kimura K，Endo Y，Yonemura Y，et al.Clinical significance of S100A4 and E-cadherin-related adhesion molecules in nonsmall cell lung cancer［J］.Int J Oncol，2000，16（6）：1125-1131.［8］Ambartsumian N，Grigorian M，Lukanidin E.Genetically modified mouse models to study the role of metastasis-promoting S100A4（mts1）protein in metastatic mammary cancer［J］.J Dairy Res，2005，72（S1）：27-33.

［9］Schmidt-Hansen B，Ornas D，Grigorian M，et al.Extracellular S100A4（mts1）stimulates invasive growth ofmouse endothelial cells andmodulates MMP-13 matrix metalloproteinase activity［J］. Oncogene，2004，23（32）：5487-5495.

S865.42

A

0529-6005（2016）08-0043-02

2015-03-06

吉林农业科技学院重点实验室培育项目（吉农院合字2013第S034号）

张宇航（1981-），男，讲师，博士生，从事临床兽医学方向研究，E-mail：zyh7680@163.com

郝景锋（1977-），男，讲师，博士生，从事临床兽医学教学及研究，E-mail：jlhjf2012@163.com

注：郝景锋与张宇航对本文具有同等贡献

刘国文，E-mail：gwliu@jlu.edu.cn；李心慰，E-mail：lixinwei100@126.com