应用PCR-焦磷酸测序技术快速检测小反刍兽疫病毒

王彩霞，杨贝娜，赵昱林，张永宁，吕继洲，冯春燕，袁向芬，邓俊花，吴绍强

（1.中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京朝阳100029；

2.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193；3.清华大学附属中学，北京海淀100084）

应用PCR-焦磷酸测序技术快速检测小反刍兽疫病毒

王彩霞1，杨贝娜2，赵昱林3，张永宁1，吕继洲1，冯春燕1，袁向芬1，邓俊花1，吴绍强1

（1.中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京朝阳100029；

2.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193；3.清华大学附属中学，北京海淀100084）

为适应小反刍兽疫快速、准确、高通量诊断的需求，建立一种基于PCR及焦磷酸测序技术平台的小反刍兽疫病毒鉴定方法。对GenBank中已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行分析，设计专用引物进行PCR扩增及焦磷酸测序，测得序列经比对分析可以确定是否为小反刍兽疫病毒感染。采用所建立的PCR-焦磷酸测序方法对西藏采集的10份血清样品进行检测，检测结果表明，该方法可以用于小反刍兽疫病毒的检测，而且该样品可初步鉴定为疫苗株感染。

小反刍兽疫病毒；聚合酶链反应；焦磷酸测序；检测

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种高度接触性传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列入法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，是《国家动物疫病中长期防治规划（2012-2020年）》明确规定重点防范的外来动物疫病之一。小反刍兽疫于1842年在南非的科特迪瓦首次发生，随后广泛流传于亚非各地，给相关国家及牧民带来了巨大的经济损失。2007年，我国西藏地区首次报告小反刍兽疫疫情，2013年疫情蔓延至新疆地区，随后在甘肃、内蒙、辽宁等多地均有报道，至2014年5月底，全国多地发生小反刍兽疫疫情，给我国畜牧业造成了巨大的经济损失，同时给羊及其产品的生产流通带来严重影响。

目前，小反刍兽疫诊断技术主要有中和试验（VN）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光抗体试验（IFAT）及逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）等方法［1-3］。焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）是近几年发展起来的一种能够进行核酸序列扩增、测定及分析的新技术，具有高通量、快速、敏感等特点，可满足口岸快检快放的原则，在提高检疫质量的同时加快检疫速度［4］。本研究根据小反刍兽疫病毒N基因的保守区域设计专用引物进行RT-PCR扩增及焦磷酸测序，建立了小反刍兽疫病毒PCR-焦磷酸测序检测、鉴定方法，并对从西藏地区采集的10份羊血清样品进行检测，结果表明，该方法可以有效检测小反刍兽疫病毒，并可对感染毒株情况进行初步推断，为我国小反刍兽疫病毒的快速检测提供技术支撑。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品PPRV Nigeria75/1疫苗株，浓度为106.8TCID50/mL，经BEI灭活后，-80℃保存备用；10份羊血清病料采自西藏地区，-80℃保存备用。

1.1.2试剂rTaq DNA聚合酶、DL-2 000 Marker、RT-PCR试剂盒One Step RNA PCR Kit（AMV）均为宝生物工程（大连）有限公司产品；PyroMark Gold Q96 SQA Reagents等相关测序试剂，购自凯杰企业管理（上海）有限公司；TRIZol LS Reagent试剂，购自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1病毒RNA提取以灭活的PPRV Nigeria75/ 1疫苗株、血清为材料，用TRIZol法提取RNA，溶解于DEPC水中，-80℃保存备用。

1.2.2引物设计通过对PPRV N基因序列的对比分析，设计通用的RT-PCR引物、焦磷酸测序引物，疫苗株特异的RT-PCR引物、焦磷酸测序引物。通用型引物序列为：UPPRVF：5′-ACCCTCGTGAGGCTCAAA-3′，UPPRVR：5′-Biotin-CCTCCTGGTCCTCCAGAATC-3′，UPPRVS：5′-ATCGGCTGAG G CACT-3′，扩增产物长度为78 bp。疫苗株特异引物序列为：SPPRVF：5′-ACAGACTGGGGATGAACGAA-3′，SPPRVR：5′-Biotin-GGCTTTCCTGAGCGTGTTC-3′，SPPRVS：5′-AAACAGATGAGGGAGAGT-3′，扩增产物长度为180 bp。引物由上海英维捷基生物技术有限公司合成，灭菌水稀释至10 μmol/L备用。

1.2.3PPRV通用型和疫苗株特异型RT-PCR扩增以灭活PPRV Nigeria75/1疫苗株基因组RNA为模板，按照TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）（DRR024A）试剂盒说明书进行RT-PCR扩增。

1.2.4单链模板制备及焦磷酸测序取10 μL PCR产物加ddH2O补充至50 μL后按照焦磷酸测序仪PyroMark Q96ID的操作说明上机进行测序反应。

1.2.5样品检测以所建立的PPRV焦磷酸测序方法检测10份采自西藏的血清样品RNA，同时设立阴阳性对照。

2结果

2.1小反刍兽疫病毒通用和疫苗毒RT-PCR扩增结果小反刍兽疫病毒通用RT-PCR和疫苗毒特异RT-PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，可见与预期大小一致的目的条带，电泳结果见图1。

图1RT-PCR扩增产物电泳检测结果

2.2焦磷酸测序结果分别对小反刍兽疫病毒通用RT-PCR扩增产物、疫苗毒特异RT-PCR扩增产物进行焦磷酸测序，测序结果见图2。小反刍兽疫病毒通用焦磷酸测序方法测得序列为：5′-CTTCAGGCTG CAGGCCATGG CCAAGATTCT GGAGGACCAG-3′。将此序列在网上进行Blast分析，结果表明序列一致性为100%的均为小反刍兽疫病毒，此方法可以确定样品是否为小反刍兽疫病毒感染。小反刍兽疫疫苗毒特异焦磷酸测序方法测得序列为：5′-CGCCTACACC AGCGACCAGAG AAGAAGTCA AAGCTGC-3′，测得序列经过比对分析，匹配一致的序列大部分为已公布的疫苗株序列，根据该比对结果可初步推断样品是否为疫苗毒感染。

2.3样品检测结果采用本研究所建立的小反刍兽疫病毒通用型和疫苗毒特异型RT-PCR方法检测西藏采集的血清样品，电泳结果显示，小反刍兽疫通用型和疫苗毒特异型RT-PCR扩增产物均有目的条带（图略）。对存在目的条带的RTPCR产物进行焦磷酸测序检测，得到的序列经Blast分析可初步判断为疫苗毒序列。由此可以判定，样品内无PPRV基因IV系流行株，即野毒株感染阴性。

图2RT-PCR扩增产物的焦磷酸测序结果

3讨论

小反刍兽疫病毒（PPRV）基因组是不分节段的单股负链RNA，从3′至5′依次分布着N-P-MF-H-L6个基因，分别编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白［5］。其中N基因编码的N蛋白是病毒内部含量最丰富的核衣壳蛋白。在感染动物血清中针对N蛋白的抗体占主导地位，基于该基因及蛋白表达而发展起来的诊断技术能快速区分鉴定小反刍兽疫和牛瘟的感染［6］。许多学者针对N基因结合新兴的分子生物学技术建立了小反刍兽疫病毒的快速检测方法。吴绍强等［7］以N基因作为靶基因建立了PPRV实时荧光PCR检测方法并应用于动物及其产品的检测。袁向芬等［8］针对N基因建立了小反刍兽疫疫苗毒株与强毒株的鉴别性荧光RT-PCR检测方法。杨卓等［9］建立了小反刍兽疫病毒RT-LAMP快速检测方法。

本研究采用PCR扩增和焦磷酸测序相结合的方法，进行小反刍兽疫病毒的测序检测，以达到从基因序列水平上对病毒进行检测鉴定的目的。根据小反刍兽疫病毒N基因的序列分析找出小反刍兽疫病毒的保守区域和疫苗毒的特异序列，利用焦磷酸测序仪携带的引物设计软件设计测序专用的扩增引物（生物素标记）和测序引物。首先对PPRV进行RT-PCR扩增，然后以测序引物上机进行测序反应，反应结束仪器自动给出测得序列，通过对测得序列的比对分析可以确定样品是否为小反刍兽疫病毒感染，并可根据疫苗株特异焦磷酸测序方法测得序列的比对分析结果对样品的感染情况进行初步推断，为下一步如何采取防控措施提供思路。

利用本研究所建立的方法对西藏采集的血清样品进行检测，结果显示，样品均存在小反刍兽疫病毒感染，但经特异性焦磷酸测序检测，可初步推断样品均为疫苗免疫血清，不存在PPRV基因IV系流行株，即野毒株感染阴性。本研究所建立的检测方法辅以目的片段特异碱基序列的焦磷酸测序方法进行病毒鉴定，使结果具有更强的可靠性和说服力，并且减少了由于PCR敏感性高而出现的假阳性结果，提高了检测特异性，可对感染状态进行准确鉴定。由此可见，本研究所建立的PCR-焦磷酸测序鉴定方法可以达到小反刍兽疫病毒基因序列水平上的快速鉴定，并可对样品的毒株感染情况进行初步的推断，在小反刍兽疫疫情的快速鉴定工作中具有一定的意义。

志谢：感谢西藏出入境检验检疫局刘忠清研究员为本研究提供了来自西藏地区的羊血清样品。

［1］Couacy-Hymann E，Bodjo S C，Koffi M Y，et al.The early detection of peste des petits ruminants（PPR）virus antigens and nucleic acid from experimentally infected goats using RT-PCR and immunocapture ELISA techniques［J］.Res Vet Sci，2009，87（2）：332-335.

［2］Bao J，Li L，Wang Z，et al.Development of one-step real-time RTPCR assay for detection and quantitation of peste des petits ruminants virus［J］.J Virological Methods，2008，148（1/2）：232-236.

［3］Sumption K J，Aradom G，Libeau G，et al.Detection of peste des petits ruminants virus antigen in conjunctival smears of goats by indirect immunofluorescence［J］.Vet Rec，1998，142（16）：421-424.

［4］陈之遥，周国华.焦测序技术的研究进展［J］.现代生物医学进展.2008，8（8）：1573-1576.

［5］杨前平，李晓峰，索效军，等.小反刍兽疫流行趋势及防控研究进展［J］.湖北畜牧兽医，2014，35（9）：73-75.

［6］龙云凤，祝贺，杨建明，等.小反刍兽疫病毒N基因在昆虫细胞中的表达［J］.动物医学进展，2011，32（12）：1-5.

［7］吴绍强，林祥梅，刘忠清，等.小反刍兽疫实时荧光PCR检测方法的建立及应用［J］.黑龙江畜牧兽医，2009（5）：18-20.

［8］袁向芬，吴绍强，林祥梅.小反刍兽疫疫苗毒株与强毒株的鉴别性荧光RT-PCR检测方法的建立［J］.中国动物检疫，2012，29（7）：30-34.

［9］杨卓，于汉勋，李巍.小反刍兽疫病毒RT-LAMP快速检测和鉴别方法的建立［J］.中国兽医科学，2015，45（9）：930-936.

Application of PCR-Pyrosequencing Technology for Rapid Detection of Pestedes petits ruminants virus

WANG Cai-xia1，YANG Bei-na2，ZHAO Yu-lin3，ZHANG Yong-ning1，LV Ji-zhou1，
FENG Chun-yan1，YUAN Xiang-fen1，DENG Jun-hua1，WU Shao-qiang1
（1.The Institute of Animal Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029，China；2.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；3.The High school Attached to Tisghua university，Beijing 100084，China）

To meet the needs for rapid，accurate and high-throughput diagnosis of Peste des petits ruminants virus（PPRV）infection，the PPRV detection assay combining with PCR amplification and pyrosequencing analysis was developed.Through comparison of the N gene sequences of PPRV isolates from different countries and areas in GenBank，two pairs of specific primers respectively targeting the conserved region and the specific region of the N gene sequence were designed for PCR amplification and pyrosequencing.The resulted sequences could be used to identify PPRV infection by Blast online.Ten sheep serum samples collected from Tibet areas were detected using the developed assay.Our results showed that the developed can be used for the detection of PPRV，and the 10 serum samples were identified as PPRV vaccine strain infection by the assay.

Peste des petits ruminants virus（PPRV）；Polymerase Chain Reaction（PCR）；pyrosequencing；detection

WU Shao-qiang

S852.65+9.5

A

0529-6005（2016）08-0003-03

2016-04-20

“十二五”国家科技支撑计划课题（2013BAD12B01）

王彩霞（1982-），女，助理研究员，硕士，从事动物检疫工作，E-mail：friday128@sina.com

吴绍强，E-mail：sqwu@sina.com