中药制剂分析课的体验式教学改革研究与实践

刘小花, 侯作贤, 张梦婷, 王　影, 封士兰

(1. 兰州大学 药学院, 甘肃 兰州　730000；2. 兰州大学 资产与实验室管理处, 甘肃 兰州　730000)



中药制剂分析课的体验式教学改革研究与实践

刘小花1, 侯作贤2, 张梦婷1, 王影1, 封士兰1

(1. 兰州大学 药学院, 甘肃 兰州730000；2. 兰州大学 资产与实验室管理处, 甘肃 兰州730000)

将体验式教学应用于中药制剂分析课程,以培养学生的动手能力、实验设计能力及理论与实践的结合能力为目的,让学生有机会对先进的大型仪器进行体验式上机操作。具体实施是以甘肃道地药材“黄芪”为研究对象,建立其多种指标成分含量测定的方法,让研究生和本科生独立完成实验,以此促进学生学习的积极性和主动性,真正实现教学与科研的充分结合,达到以教学促进科研、以科研提升教学的目的。

中药制剂分析； 超高效液相色谱； 体验式教学

体验式教学[1-4]是培养学生使之具有独立、自主和创新精神,以学生的自我体验为主要学习方式,力求在师生互动和学生亲身体验的过程中达到认知与体验过程的有机结合的一种教学方法。与传统的教学模式相比较,体验式教学以学生为主体,注重感觉体验,鼓励学生自我探索。体验式教学是适应当代大学生需求的教学方式。 体验式教学的价值和意义不仅提供了一种教学方法,更重要的是提供了一种有助于学生主体开展思考的教学理念[2]。体验式教学有4种模式:情境体验、案例体验、实践体验和拓展活动体验[4]。

高效液相色谱技术是中药制剂分析中最常用也是最先进的现代分析手段,是教师必须讲授和学生必须要掌握的内容。前期兰州大学药学院实验中心推进本科生综合实验和设计性实验改革[5-7],取得了不错的成绩,积累了一定经验。本项目要求学生查阅大量的关于黄芪药材含量测定方法的文献[8-13],要求学生尽可能选择多种实验方案,通过对样品处理方法的选择和色谱测定条件的优化,用对照品进行比对,建立UPLC(超高效液相色谱)法测定黄芪中多种指标成分含量的实验方法,并与HPLC(高效液相色谱)法测定其含量[7]进行比较,寻找出UPLC的优势。通过此项目的建立使学生掌握超高效液相色谱仪的使用和维护,了解药物分析及中药制剂分析的一般流程,激发学生实践学习的积极性,有利于培养学生的动手能力、仪器的使用与操作,以及综合思维与创新能力。

1　实验

1.1仪器与试剂

仪器:超高效液相色谱仪(Waters ACQUITYTM UPLC),KQ3200DB超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司),电热恒温水浴锅(上海恒一),分析天平(BS224S型,十万分之一,德国Sartorius赛多利斯)。

试剂:乙腈,色谱纯,德国默克公司；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

黄芪药材:自采或购买(见表1),经兰州大学药学院生药学研究所马志刚教授鉴定为蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fish.) Bge. Var. mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根。

对照品:毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素均购自中国食品药品检定研究院。

表1　黄芪药材来源与品种

1.2黄芪药材提取物制备

称取黄芪药材2 g,用10倍量的95%乙醇回流提取,共提取3次,每次1 h,合并提取液,将提取液蒸发浓缩,得黄芪提取物浓缩液,置于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.3标准溶液配制

分别取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、金雀异黄酮标准品适量,用甲醇配制成质量浓度分别为0.100、0.130、0.116、0.103、0.157 mg·mL-1的对照品溶液,置于4 ℃冰箱冷藏备用

1.4色谱条件

Fluoro-Phenyl 色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)；流动相为乙腈和超纯水,梯度洗脱,洗脱程序见表2；进样量2 μL；柱温25 ℃；检测波长254 nm。

表2　梯度洗脱条件

2　实验结果与讨论

2.1色谱条件选择

经查阅文献[11-13],确定了最佳色谱条件:流动相组成为乙腈和水,洗脱方式为梯度洗脱,流速为0.3 mL·min-1。该色谱方法使所得的色谱峰窄,峰形较好,且使得各分析物得到了很好的分离。

2.2方法学考察

2.2.1线性关系

分别取“1.3”项下对照品储备液,以及毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素,均以进样量(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归。结果表明这5种化合物的回归方程均呈良好的线性关系,见表3。

表3　4种化合物在生物样品中的标准曲线和相关系数

2.2.2 精密度实验

取对照品溶液测定日内精密度和日间精密度。同一对照品溶液在同一天内连续进样6次,每次进样5 μL,计算日内精密度,5个黄酮类化合物的RSD见表4。

同一对照品溶液连续3天每天进样2次,计算日间精密度,5个黄酮类化合物的RSD见表4。

日内和日间精密度的RSD<2%,符合规定。

2.2.3重复性实验

取1号黄芪药材(来自于临夏地区)6份,每份2 g,精密称定,制备成供试品溶液,按照样品测定方法测定。测得5个黄酮类化合物的平均含量和RSD,结果见表4。5种化合物重复性试验的RSD<2%,符合规定。

表4　5个黄酮类化合物的精密度和重复性实验结果

2. 2.4准确度实验

以加样回收率考察准确度。取同一批已知含量的1号黄芪药材(来自于临夏地区)5份,每份2 g,精密称定,各加入适量的各种对照品溶液(毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素的质量浓度分别为0.100、0.130、0.116、0.103、0.157 mg·mL-1),按照供试品溶液制备中的操作测定,计算5个化合物的加样回收率,结果见表5。5个黄酮类成分平均回收率在96.86%～101.09%,RSD<2%,符合规定。

表5　加样回收率试验结果(n=5)

表5(续)

2.3样品测定

取6批黄芪药材,制备成样品溶液,精密吸取2 μL进入UPLC仪进行分析,含量测定结果见表6,色谱图见图1、图2。

表6　黄芪药材中5种黄酮类成分的含量

由图1、图2可知,通过与对照品比对,鉴别出黄芪药材提取物的UPLC色图谱中5个色谱峰的结构,F1—F5号峰对应的化合物分别为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、金雀异黄酮、芒柄花素,其保留时间分别为1.912、3.484、4.018、4.703、5.569 min。

3　结果与讨论

3.1提取效能评价

该实验要求学生查阅中药中常用的几种样品处理方法的操作和使用,使学生熟悉回流提取、超声提取和索氏提取法等样品提取方法,并采用不同溶剂进行提取；实验结果显示,选用95%乙醇作为溶剂对6批来自不同产地的黄芪药材进行回流提取,5个黄酮类成分在该提取条件下得到的提取率高、提取时间短、操作简单,适合于学生实验。

图1　6批黄芪药材提取物UPLC-DAD 色谱图(254 nm)

图2　黄芪药材与5个对照品UPLC-DAD 色谱图(254 nm)

3.2检测系统评价

采用UPLC法对6批来自不同产地的黄芪药材进行黄酮类成分的含量测定,测得各对照品的最大吸收波长如下:毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷为258.1 nm,芒柄花苷为249.8 nm,毛蕊异黄酮为248.7 nm,金雀异黄酮为259.3 nm,芒柄花素为248.7 nm。本实验选取254 nm为检测波长,对这5个黄酮类成分进行分析,其结果准确、重复性好。说明将UPLC法应用于黄芪药材中黄酮类成分的质量控制中效果好。

3.3含量测定分析

用UPLC法测定黄芪药材内5种黄酮类成分含量大小的顺序为:毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷>毛蕊异黄酮>芒柄花苷>芒柄花素>金雀异黄酮,其结果与用HPLC法测定的顺序一致。6批药材中的金雀异黄酮含量均少于2 μg·g-1,而以往的研究使用HPLC法测定黄芪药材中成分的含量,由于HPLC法灵敏度低,金雀异黄酮的峰形不易被发现,这也解释了为何至今未见金雀异黄酮在黄芪药材中报道的现象。

从表6中可发现,即使是同一对照品在6批不同的黄芪药材中的含量也会有较大的差异,这可能与黄芪的生长环境、生长年限以及储藏时间等因素有关。

3.4UPLC与HPLC比较

与HPLC比较,UPLC法分析时间更短、灵敏度更高。同时测定黄芪中5种黄酮类成分,UPLC法完成一次样品运行时间只需8 min,而HPLC法需要45 min。使用UPLC法的流速为0.3 mL·min-1,而HPLC的流速为1 mL·min-1,结果比较得出,UPLC法使用的溶剂更少,该方法更绿色和环保。

4　结语

在教学实施过程中,学生在倾听、动口、动手等沟通讨论研究的过程中,又各自分享了不同的亲历感受,这种经验的分享有助于学生对事物认识的深化,也有助于学生立场与观点的重新定位与补充。对教师而言,让整个的课堂活动成为学生自己的事情,让他们自己去查阅相关资料、小组成员共同设计方案,由指导教师修订方案,最后由学生独立完成。学生通过对比、换位、揣摩、尝试,去体会、感受,让他们自己去交流,去总结,去运用。这种建立在充分自主活动基础上的学习,能够极大地调动学生已有的知识背景,在活动中形成新的知识体验,并最终产生学习的“意义”。

通过对本项目的实施,使学生掌握超高效液相色谱仪的理论知识和实践运用。通过回流提取、超声提取和索氏提取法进行比较,使学生熟悉中药制剂分析提取的几种样品处理方法的操作和使用。建立多种指标成分含量测定的方法学考察实验,包括色谱条件选择、线性关系、稳定性考察、精密度试验、重复性试验、准确度试验、样品测定,可以使学生了解中药制剂分析的一般流程,同时掌握UPLC法和HPLC测定中药中指标成分的方法以及它们的差异。

通过该体验式教学,给学生提供最大的自由空间,提高了学生的创新能力,使他们能够充分发挥自身的实践能力,学习和使用现代技术手段、了解和应用当前新技术,牢固掌握所学的理论知识。

References)

[1] 王玉娥.体验式教学法的探索与实践[J].重庆第二师范学院学报,2015,28 (6):148-151.

[2] 瞿伟,谷珊珊.体验式教学在军医大学医学心理学课程中的应用与探索[J].西北医学教育,2012,20(6):1176-1178.

[3] 郭瑞昕,李文红,吴盛美,等.药学类环境微生物学课程体验式教学模式的探索与实践[J].药学教育,2015,31(1):57-61.

[4] 卢颖,徐绍方.体验式教学模式浅析[J].教学研究,2016(2):54.

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[6] 刘小花,胡芳弟,崔方,等.将芦丁提取分离实验打造为综合设计性实验[J].实验技术与管理,2012,29(10):160-162.

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[8] 中华人民共和国药典委员会.中国药典:一部[M].北京:化学工业出版社,2005:212-213.

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Research and practice on experimential teaching reform for Pharmacy Analysis of Traditional Chinese Medicine course

Liu Xiaohua1, Hou Zuoxian2, Zhang Mengtin1, Wang Ying1, Feng Shilan1

(1. School of Pharmacy,Lanzhou University, Lanzhou 730000, China;2. Department of Assets and Laboratory Management, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

In order to cultivate students' practical ability, experimental design ability and combination ability of theory and practice, and enable the students to have the opportunity to experience the operation of the advanced large-scale instruments on their own, the experiential teaching is applied to Pharmacy Analysis of Traditional Chinese Medicine course. Taking Radix Astragaliis as the research object, a method of determining the content of multi-index constituents by UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography) is adopted. Undergraduate and graduate students are encouraged to complete the experiment independently, and their enthusiasm and initiative in using the large-scale instruments are promoted.The combination of teaching with research is well completed, the research and teaching are stimulated, and the purpose for promoting research by teaching and stimulating teaching by research is realized.

Pharmacy Analysis of Traditional Chinese Medicine; UPLC; experimental type teaching

10.16791/j.cnki.sjg.2016.10.050

2016-04-13修改日期：2016-05-26

中央高校基本科研业务费专项资金(lzujbky-2015-59)；兰州大学2016年教学改革项目；兰州大学2016年实验技术创新基金项目

刘小花(1976—),女,甘肃兰州,博士,高级实验师,研究药物分析学.E-mail：liuxiaoh@lzu.edu.cn

R917

A

1002-4956(2016)10-0199-05