稀土元素镝对大肠杆菌生长效应研究

米新宇, 刘雅琼, 袁　兰, 黄宁华, 曾　静, 任霄剑, 王京宇

(1. 北京大学 公共卫生学院, 北京　100191; 2. 北京大学 医药卫生分析中心, 北京　100191)



稀土元素镝对大肠杆菌生长效应研究

米新宇1, 刘雅琼1, 袁兰2, 黄宁华1, 曾静1, 任霄剑1, 王京宇1

(1. 北京大学 公共卫生学院, 北京100191; 2. 北京大学 医药卫生分析中心, 北京100191)

采用酶标仪监测大肠杆菌的生长速度,研究培养液中稀土元素Dy3+浓度对大肠杆菌生长的影响。培养液中添加的Dy3+浓度系列为0～12.8 mg/L,培养时间为0～9 h。实验结果显示:培养时间为2～3 h,任何一个Dy3+浓度的培养液均对大肠杆菌呈现生长刺激作用；3 h后,Dy3+浓度低于6.4 mg/L的培养液继续保持生长刺激作用,而高于9.6 mg/L的培养液则对大肠杆菌生长产生抑制作用；随着培养时间的延长,无论是刺激还是抑制作用均呈现逐渐减弱的趋势;在全浓度范围内,大肠杆菌表现出一致性地随Dy3+浓度升高生长对数期内细胞分裂最活跃的时间点逐渐延后的现象。

大肠杆菌; Dy3+; 对数期

大肠杆菌数目是世界卫生组织以及我国环境水质监测和食品安全中重要的微生物检测指标[1]。同时,大肠杆菌具有实验技术成熟、操作简便、稳定性好、生长迅速适宜等优势,因此本实验将大肠杆菌作为模型生物,探索稀土元素镝对大肠杆菌生长速度的影响。早在80年代,我国学者就已开始了稀土元素生长刺激作用的研究,并将其应用于农业增产[2-4]。目前关于稀土元素对微生物作用的研究多集中在La、Y、Gd等轻稀土元素[5-6],然而从微生物化学元素丰度背景考虑,重稀土元素在微生物体内背景值远远低于轻稀土元素,对排除研究中的待测元素本底值有重要意义。因此,本实验选取在培养过程中本底值接近于零的重稀土元素镝作为刺激元素。

酶标检测仪是一种高级光度计式读数仪,具有检测方便、测量准确、高性能、灵活性和稳定性的特点[7]。基于酶标仪的吸光度法(比浊法)是测定菌液浓度的常用方法之一,其准确、便捷、稳定的特点长期以来为研究者所认可[8-9]。

1　实验

1.1实验材料与仪器

材料:硝酸(HNO3)为UP级,苏州品瑞化学有限公司;过氧化氢(H2O2)为UP级,苏州品瑞化学有限公司;氯化钠为分析纯,北京化工厂;超纯水电阻率>18.2 MΩ;标准溶液从国家有色金属及电子材料分析测试中心购置,质量浓度为1 000 mg/L;菌种为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心产品,大肠杆菌(E.coli)1.487;牛肉粉为LP0029,OXOID;蛋白胨为LP0042,OXOID。

仪器：摇床为ZWY多幅轨道式恒温培养振荡器,上海量壹科学仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅为SX-700高压蒸汽灭菌锅,TOMY；酶标仪为Model 550,BIO-RAD。

1.2实验方法

按照实验要求活化扩增大肠杆菌菌种。取等量(10μL)活化菌液接种至20 mL、质量浓度为1.6、3.2、6.4、9.6、12.8 mg/L的Dy3+离子系列培养液(分别记为实验组1、2、3、4、5),37 ℃摇床内培养，于2～9 h内,每小时采用酶标仪测定各组菌液的吸光度值(OD值)。波长550 nm,每孔加样量200 μL。

2　结果与讨论

2.1菌液吸光度值

根据朗伯-比尔定律,当入射光波长和溶液厚度一定时,样品吸光度(OD值)与溶液浓度成正比,菌液吸光度与活菌数在一定浓度范围内具有较好的线性关系,可以据此监测活菌数的变化[10]。因此,本次实验使用吸光度作为菌液活菌数的观测指标。

表1给出了0～12.8 mg/L的Dy3+大肠杆菌培养2～9 h吸光度值(表1中t为培养时间)。由表1可以观察到下述现象:

表1　0～12.8 mg/L的Dy3+大肠杆菌菌液培养2～9 h吸光度值

注：实验组1—5 分别对应1.6、3.2、6.4、9.6、12.8 mg/L的Dy3+剂量组

(1) 培养2 h后,对照组大肠杆菌菌液吸光度值表现出持续增长的趋势,且随着培养时间的延长吸光度数值增长放缓并逐渐趋于稳定；

(2) 培养时间少于2 h的各个剂量组OD值均高于对照组(无Dy3+),而培养3 h之后OD值变化则分化成两类:1—3组的OD值明显高于对照组；4—5组的OD值除初值外明显低于对照组。4—5组OD值起初高于对照组,随后又低于对照组的现象尚未见报道;

(3) 随培养时间增加,较高浓度剂量组的OD值有逐渐趋近甚至超越较低浓度剂量组OD值的趋势,后文中将对此现象加以讨论。

2.2Dy3+含量对细菌生长速度的影响

表2为各剂量组菌液在各时间点与对照组相比的相对生长速率,相对生长速率数值大于100%表示该剂量组大肠杆菌生长速率高于对照组,Dy3+表现出刺激生长作用；反之,小于100%则认为Dy3+显示出生长抑制作用。

表2　各Dy3+剂量组大肠杆菌相对生长速率　%

注：实验组1—5 分别对应1.6、3.2、6.4、9.6、12.8 mg/L的Dy3+剂量组

与对照组相比,培养2 h各实验组均表现出明显的生长刺激作用,实验组的大肠杆菌生长速度分别为对照组的157.1%～271.4%。这与研究中常常提及的毒物低浓度兴奋效应(hormesis)相吻合[11-13]。

培养3 h后,Dy3+各剂量组分别表现出对大肠杆菌生长的刺激或抑制作用。第1—3剂量组相对生长速率均高于对照组,其平均相对生长率分别为对照组的132.4%、135.1%和129.9%,显示出生长刺激作用；而第4和第5剂量组相对生长速率则均低于对照组,其平均相对生长率分别为对照组的81.3%和36.4%,表现出生长抑制作用。统计学分析显示，上述各剂量组与对照组间的差异均具有显著性(P<0.05)。这种低浓度呈现刺激、高浓度呈现抑制的现象与毒物低浓度兴奋效应(hormesis)中双相剂量-效应关系的表述相符,即细胞/组织在暴露于低剂量毒性因素而产生的适应性良性反应,而当毒性因素为高剂量时则产生损害[11-14]。然而,第4和第5剂量组出现相对生长速率随着培养时间的延长由高于100%转向低于100%的现象。现有的资料显示hormesis效应的确会随时间变化[14]。Stebbing[15]在论著中也认为在讨论hormesis效应模型时不应当缺少时间的要素。

观察各组菌液2～9 h时相对生长速率的变化趋势可以发现,随培养时间延长,各组的生长刺激或抑制作用均逐渐减弱,实验组相对生长率有向对照组趋同的变化趋势。这种刺激以及抑制作用强度趋同的现象可能是细菌对Dy3+离子的适应性增强所致,也有可能与培养液中Dy3+被细菌富集、环境中的Dy3+浓度降低有关,需要更进一步的实验研究。

2.3比生长速率与对数增长期

比生长速率μ指单位时间、单位质量的菌体所增加的菌体量,是描述微生物生长的常用指标,能较好地描述停滞期、对数期、稳定期细菌生长情况[16-17]。比生长速率越高代表细胞分裂越活跃,对数期内最大比生长速率μmax则对应该时期内细胞分裂最快的阶段。

(1)

式中：μ为比生长速率,h-1；t为大肠杆菌生长时间,h；N为该时刻微生物细胞量。

当积分时间为n～n+1 h时,有:Nn+1-Nn=μnNn,即

(2)

式中，Nn为第n小时初始细菌总数,Nn+1为第n+1小时初始的细菌总数,μn为该时细菌生长的比生长速率。

如前文所述,菌液OD值与菌液浓度呈良好的线性相关,因此,大肠杆菌生长n小时的比生长速率μn为

(3)

式中,ODn为第n小时开始时菌液的OD值,ODn+1为第n+1小时开始时该菌液的OD值。

表3为不同Dy3+浓度下各时间段内各组大肠杆菌菌液每小时比生长速率。可以看出,对照组大肠杆菌在2～3 h比生长速率最大,菌数增长最快,培养3～4 h以后,比增长率大幅降低并趋于稳定,保持在较低水平,细菌生长从对数期转换到平台期。

图1为对照组与第1和第2剂量组大肠杆菌菌液各时段比生长速率变化曲线,3个组均呈现出比生长速率迅速下降,随后保持在较低水平的趋势。

表3　不同Dy3+剂量组大肠杆菌各时段比生长速率μn

注：实验组1—5 分别对应1.6、3.2、6.4、9.6、12.8 mg/L的Dy3+剂量组

对照组与第1和第2剂量组大肠杆菌在2～3 h比生长速率较高,细菌分裂速度快,可初步判断为生长对数期；培养3～4 h以后,比增长率大幅降低并趋于稳定,保持在较低水平,生长对数期结束。

图1　对照组与第1、第2 剂量组大肠杆菌比生长速率变化

图2为第3—第5剂量组大肠杆菌菌液各时段比生长率变化,3个剂量组均呈现出比生长率存在先上升后下降,而后稳定在较低水平的趋势。第3剂量组(6.4 mg/L)比生长率2～3 h内上升,3～4 h达到最大,此时为对数期内细胞分裂最活跃的阶段；4～5 h下降至稳定,生长对数期结束;第4剂量组(9.6 mg/L)比生长率2～3 h内开始上升,3～4 h达到最大,细胞分裂最活跃；5～6 h下降稳定至较低水平,对数期结束;第5剂量组(12.8 mg/L)菌液比生长率4～5 h内开始上升,6～7 h达到最大,细胞分裂最活跃；7～8 h下降至较低水平,对数期结束。

图2　第3—第5剂量组大肠杆菌比生长速率变化

观察这3个高剂量(6.4～12.8 mg/L)组比生长速率变化可以看出,随Dy3+浓度升高,大肠杆菌对数生长期内细胞分裂最活跃的时间点有逐渐延后的趋势。

比较图1和图2,虽然不能确定前3组(0～3.2 mg/L)最大比生长速率出现的时间,但可以初步判断这个时间点并不在2～3 h以后,早于后3组。因此可以推断:在整个0～12.8 mg/L Dy3+浓度系列所有的剂量组中,无论在表现出生长刺激或抑制的剂量下,大肠杆菌都表现出一致的、连续的随Dy3+离子浓度提高生长对数期内分裂最活跃的时间点(对应μmax)逐渐延后的现象。这种猜想与以往的在某一时间点观察增长速率的研究方法有所不同。

生长对数期内分裂最活跃的时间点出现的时间越晚,则菌液内在μmax之前积累的细菌总数越多,这将导致其在分裂最活跃时期细菌总数增长越快。另外,当高浓度组进入分裂最活跃阶段时,低浓度组与对照组菌液处于生长稳定期,比生长速率低,分裂活跃度较低。这两种因素都将造成表1中观察到的高浓度组在较晚时间段相对生长速率反超低浓度组的趋势。同时,这或许从一个侧面解释了前面提及的所有剂量组相对生长率趋同的现象。对此,Celabrese主张的过度补偿模型认为:hormesis是生物系统稳态被理化刺激物破坏后所做出的一种过度补偿的现象,而这种过度补偿的具体表现就是生长刺激[18]。这种主张与本次实验所观察到的hormesis效应随时间变化的现象相对应。

3　结论

(1) 通过比较各组菌液各时间点菌液吸光度及相对生长速率发现：细菌培养2～3 h,0～12.8 mg/L Dy3+各剂量组均表现出生长刺激作用；3 h后开始,当浓度不高于6.4 mg/L时Dy3+刺激大肠杆菌生长；当浓度在9.6 mg/L及以上时Dy3+抑制大肠杆菌生长,表现为Hormesis效应。同时,随培养时间增加,所有剂量组均表现出的生长刺激、抑制作用逐渐减弱,相对生长速度逐渐向对照组接近的趋势。

(2) 通过分析Dy3+浓度系列中各组比生长速率变化发现,无论是刺激还是抑制的剂量组都表现出一个相同趋势,即:Dy3+浓度升高、生长对数期内分裂最活跃的时间点(μmax)逐渐延后。这或许对解释Dy3+对大肠杆菌的生长刺激或抑制现象有一定的意义。

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Study of rare-earth element Dy on growth of E.coli

Mi Xinyu1, Liu Yaqiong1, Yuan Lan2,Huang Ninghua1, Zeng Jing1, Ren Xiaojian1, Wang Jingyu1

(1. School of Public Health,Peking University,Beijing 100191, China;2. Center of Medical and Health Analysis,Peking University,Beijing 100191, China)

In order to study the effect of REE(rare-earth element) Dy3+in different concentration on the growth of E.coli,the growth rate of E. coli cultured in broths is monitored by a microplate reader. There are a series of broths containing 0～12.8 mg/L Dy3+used in the 9-hours cultivation. The result shows that at the first 2-3 hours,the whole Dy3+concentration series can show a growth-stimulating effect on E.coli; with the beginning of the 3rd hour,Dy3+stimulates growth with a concentrations not higher than 6.4 mg/L,and inhibits when the concentration raises to 9.6 mg/L or above; both inhibition and stimulation show a gradual weakening trend with time. In addition,in the whole concentration range,the logarithm of the growth of E. coli consistent delaying with Dy3+concentration increases.

E.coli; Dy3+; logarithmic phase

10.16791/j.cnki.sjg.2016.10.017

2016-05-17修改日期：2016-05-30

北京市自然科学基金项目“无机指纹与常见致病菌快速检定”(2122051)资助

米新宇(1990—)，男，北京，硕士研究生，主要从事稀土元素方面的实验和研究E-mail：1036656180@qq.com

王京宇(1956—)，男，北京，博士，教授，博士生导师，主要从事生命元素组学研究.E-mail：wjy@bjmu.edu.cn，82801107

X703.1

A

1002-4956(2016)10-0064-04