间接免疫荧光技术在内质网观察实验教学中的应用

王宏刚, 陈成彬, 王春国, 陈　力, 宋文芹, 白艳玲, 张金红, 刘　方

(南开大学 生物实验教学中心, 天津　300071)



间接免疫荧光技术在内质网观察实验教学中的应用

王宏刚, 陈成彬, 王春国, 陈力, 宋文芹, 白艳玲, 张金红, 刘方

(南开大学 生物实验教学中心, 天津300071)

内质网的观察实验一直是“细胞生物学实验”的经典教学内容,该实验的教学主要采用活体染色的方式来开展。为了提高实验教学的效果,将间接免疫荧光技术应用到该实验的教学中。在实验过程中,利用小鼠抗人钙网蛋白的单克隆抗体和FITC标记的山羊抗小鼠的荧光二抗对广泛存在于内质网上的钙网蛋白进行标记,通过荧光显微镜观察Hela细胞中内质网的基本形态和分布情况。将间接免疫荧光技术应用于内质网观察实验的教学中,可以让学生掌握科研中常用的内质网标记技术,提高他们对科研工作的兴趣,有助于培养他们的创新思维和科研综合素质。

间接免疫荧光； 内质网； 实验教学

内质网是一种非常重要的细胞器,担负着细胞内合成蛋白质的重要作用[1]。目前,跟内质网相关的科学研究也非常活跃[2-4]。对于生命科学及相关专业的本科生来说,内质网的结构和功能也是非常重要的知识点。内质网的显微观察一直是“细胞生物学实验”的经典教学内容,在传统的实验教学中,主要采用活体染色的方式进行[5]。随着实验教学研究的深入,这种教学方式逐渐暴露出内容单一的缺点,不能适应现代实验教学的需要。目前,将科研中常用的实验技术应用到实验教学是实验教学改革的重要方向[6-9]。按照这一思路,我们采用科研中常用的内质网标记方法——间接免疫荧光法对内质网的观察实验进行改革,取得良好的教学效果,受到学生的欢迎。

1　实验材料与试剂

1.1实验材料

人宫颈癌细胞HeLa细胞系。

1.2主要试剂

DMEM培养基、小牛血清、双抗、胰蛋白酶、PBS缓冲液、2%BSA (PBS缓冲液配制)、4%多聚甲醛、TritonX-100、小鼠抗人钙网蛋白的单克隆抗体、FITC标记的山羊抗小鼠的荧光二抗、防荧光淬灭封片剂(含DAPI)。

2　实验方法

(1) 实验前一天选择生长状态良好的HeLa细胞制作细胞爬片。

(2) 在实验当天取出培养皿中的DMEM培养基(含10%小牛血清、1%双抗)。加入37 ℃预温的PBS洗涤3次,每次5 min。吸去PBS,加入4%多聚甲醛溶液对细胞进行固定。

(3) 15 min后吸去多聚甲醛,加入用37 ℃预温的0.1% TritonX-100处理5 min。

(4) 吸去TritonX-100,使用PBS洗涤3次,每次5 min。吸去PBS,用滤纸轻轻吸去片子上的液体,滴加20 μL 2%BSA封闭液,盖上培养皿盖,室温下封闭15 min。

(5) 吸去封闭液,滴加20 μL 1∶200稀释的小鼠抗人钙网蛋白的单克隆抗体,盖上一块比细胞爬片略小的封口膜和培养皿盖,37 ℃孵育20 min。

(6) 用PBS洗涤3次,每次5 min。用滤纸小心吸去片子上的液体,滴加20 μL 1∶500稀释的FITC标记的山羊抗小鼠荧光二抗,盖上封口膜和培养皿盖,37 ℃孵育20 min。

(7) PBS洗涤3次,每次5 min。孵育结束后用蒸馏水洗涤片刻,将盖片风干。

(8) 在干净载玻片上滴加3 μL含有DAPI的防荧光淬灭剂,将长有细胞的盖玻片从培养皿中取出,反扣于淬灭剂上。使用荧光显微镜观察,并用冷CCD拍照。

3　实验结果

通过荧光显微镜可以观察到经紫外线激发后,被DAPI标记的细胞核发出蓝色荧光；经蓝光激发后,被FITC标记的内质网钙网蛋白发出绿色荧光。在正常状态下,HeLa细胞中内质网充满整个细胞,并在细胞核周围密度较高(见图1)。

图1　Hela细胞中内质网的分布(100×)

4　讨论

4.1教学注意事项

(1) 在实验材料的选择上,建议选择生长较快、对培养条件要求较低、贴壁生长的细胞系,以降低实验材料准备的难度,提高实验的教学效率。

(2) 需要注意细胞的生长状态,状态不好的细胞,其内质网的分布、结构等特点均会发生改变,会对实验结果造成较大的影响。

4.2教学组织

(1) 本实验中,抗体的稀释倍数、用量和孵育时间可以根据课程的学时数进行调整,以求获得最佳的实验结果。

(2) 荧光显微镜的数量及学生使用荧光显微镜的熟练度都会对实验造成较大的影响,如班级人数过多,可考虑分组进行实验,每个组在进行抗体孵育时采用不同的时间,错开使用荧光显微镜的时间。

4.3教学拓展

通过本实验的学习,学生可以掌握使用间接免疫荧光法标记内质网的基本方法。在此技术上,可以拓展开设其他探究性的实验内容。例如,可以通过对内质网的标记来观察细胞周期中不同时期的内质网,可让学生掌握细胞周期中内质网的变化情况。还可以选择一些药物对细胞进行处理,然后观察药物对细胞内质网的影响。

5　结语

细胞核与细胞器的相关知识一直是“细胞生物学实验”的经典教学内容,在“细胞生物学实验”的教学体系中占有重要的地位[5,10-11]。随着教学改革的推进,传统的实验设计模式已经逐渐不能适用现代实验教学的需求。如何对这些经典的实验内容进行改造,使其重新焕发活力已经成为实验教学改革的重要课题。本文以内质网观察实验为突破口,将科研中常用的实验技术引入这些经典内容的教学过程,希望能够借此培养学生对科学研究的兴趣,提高学生的创新思维和综合科研素质,为他们未来的发展奠定坚实的基础[12-13]。

References)

[1] 翟中和,王喜忠,丁明孝,等.细胞生物学 [M].4版.北京:高等教育出版社,2011.

[2] 陈娜子,姜潮,李校堃.内质网应激与疾病[J].中国生物工程杂志,2016,36(1):76-85.

[3] 张婧,范瑛,汪年松.内质网应激与肾脏疾病[J].中国中西医结合肾病杂志,2016,17(1):71-75.

[4] 杨琼,吴永全.内质网应激与心血管疾病[J].心脏杂志,2015,27(1):99-101.

[5] 王崇英,高清祥.细胞生物学实验[M]. 3版.北京:高等教育出版社,2011.

[6] 闫国栋,权宇彤,汤海峰,等.生命科学实践教学体系的改革与实践[J].实验技术与管理,2015,32(8):6-8,33.

[7] 林跃强,刘晓东,李建.科研成果转化为实验教学内容之探索[J].实验室研究与探索,2015,34(5):144-146,181.

[8] 张英,黎宏宇,李莉,等.流式细胞术在实验教学中的开发与应用[J],实验室研究与探索,2013,32(7):206-208,216.

[9] 王宏刚,白艳玲,朱玉山,等.细胞转染技术在本科实验教学中的应用[J].实验技术与管理,2015,32(8):68-69,74.

[10] 丁明孝,苏都莫日根,王喜忠,等.细胞生物学实验指南[M].北京:高等教育出版社,2009.

[11] 曾宪录,巴雪青,朱筱娟.细胞生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,2011.

[12] 于志军,柏峰,周春江.深化遗传学实验改革,提升学生科研兴趣与创新意识[J].高校实验室工作研究,2015(1):7-8.

[13] 闰晓梅,王莲芸,秦敏,等.试论实验教学中学生科研素质的培养[J].高校生物学教学研究,2013,3(3):39-44.

Application of indirect immune fluorescent technology in experimental teaching of Endoplasmic Reticulum Observation

Wang Honggang, ChenChengbin, Wang Chunguo, Chen Li, Song Wenqin,Bai Yanling, Zhang Jinhong, Liu Fang

(Biological Experimental Teaching Center, Nankai University, Tianjin300071, China)

The experiment ofEndoplasmic Reticulum Observation is always the classical teaching content of Cell Biology experiment, which is carried out byusing vital staining. In order to improve the effect of the experimental teaching, the indirect immunefluorescent technology is applied to the teaching for Endoplasmic Reticulum Observation. In the experiment, by using the antibody monoclonal anti-calreticulin from mouse and FITC-labeledgoat anti-mouse fluorescent secondary antibody, the calreticulin which widely exists in the endoplasmic reticulum is labeled, and the basic shape and distribution of the endoplasmic reticulumin Hela cell are well observed by the fluorescent microscope. Applying the indirect immunefluorescent technology to the teaching of Endoplasmic Reticulum Observation can help our students to learn the technique of endoplasmic reticulum marking which is often used in research, stir up their interest in research work and train their innovative thinking and comprehensive quality of scientific research.

indirect immunefluorescence; endoplasmic reticulum; experimental teaching

10.16791/j.cnki.sjg.2016.10.042

2016-04-01

国家基础学科人才培养基金“条件建设项目”(J1310003)；南开大学2014年本科一般教学改革项目“将现代实验技术引入本科实验教学,构建‘公能’特色实验教学内容体系”

王宏刚(1982—),男,山西繁峙,硕士,实验师,从事“细胞生物学实验”“遗传学实验”教学

陈成彬(1972—)男,河北冀州,博士,副教授,研究方向为分子细胞遗传学,主要从事“细胞生物学”“遗传学”“细胞生物学实验”教学.E-mail：chencb@nankai.edu.cn

G642.423

A

1002-4956(2016)10-0168-03