HPLC法测定清肺消炎丸中三种抗炎成分含量

崔庆新, 廖承美, 陈志凯, 马　芳, 陶　瑾

(南开大学 药学院, 天津　300071)



HPLC法测定清肺消炎丸中三种抗炎成分含量

崔庆新, 廖承美, 陈志凯, 马芳, 陶瑾

(南开大学 药学院, 天津300071)

采用高效液相色谱法(HPLC)对清肺消炎丸中牛蒡子苷、牛蒡子苷元和绿原酸进行定量测定。色谱柱:Symmetry© C18柱。流动相:牛蒡子苷、牛蒡子苷元采用甲醇-水(体积比为50∶50),检测波长280 nm；绿原酸采用乙腈-0.4%的磷酸(体积比为13∶87),检测波长327 nm。 结果表明,清肺消炎丸中含牛蒡子苷4.07 mg/g,牛蒡子苷元0.19 mg/g,绿原酸0.076 mg/g。牛蒡子苷、牛蒡子苷元和绿原酸进样量分别在1.94～9.70 μg、0.20～1.00 μg、0.05～0.25 μg范围内与峰面积的线性关系良好。牛蒡子苷、牛蒡子苷元和绿原酸的回收率分别为102.59%(RSD=1.69%,n=5)，98.17%(RSD=1.52%,n=5)和98.33%(RSD=1.46%,n=5)。该方法简单、精确、灵敏、专属性强、重复性好，可定量测定清肺消炎丸中抗炎物质含量。

清肺消炎丸； 牛蒡子苷； 牛蒡子苷元； 绿原酸； 高效液相色谱

清肺消炎丸配方包含8味药材:麻黄、石膏、地龙、牛蒡子、葶苈子、人工牛黄、炒苦杏仁和羚羊角。牛蒡子是清肺消炎丸中起主要活性的药材之一,为二年生菊科植物的干燥成熟果实。牛蒡子中含有多种化学成分,主要包括木脂素类、萜类、挥发油、脂肪酸和酚酸衍生物。其中,牛蒡子苷和牛蒡子苷元是木脂素类中代表性有效成分[1],具有抗炎[2]、抗肿瘤[3]、热休克反应抑制[4]等药理作用；绿原酸在牛蒡子中也有发现[5],属于酚酸衍生物类,广泛分布于植物界,具有抗氧化[6]、抗炎[7]、抗诱变和抗肿瘤[8]、抗菌、抗病毒[9]、降血糖[10]等药理作用。

现有文献缺乏明确的清肺消炎丸中上述3种抗炎成分含量的具体测定方法。为能更好地控制清肺消炎丸的质量,本文采用高效液相色谱法(HPLC)对这3种抗炎成分含量的定量分析方法进行探究。

1　实验

1.1仪器与材料

仪器：戴安U3000高效液相色谱仪,Chromeleon色谱工作站；离心机；超声仪；电子分析天平。

材料：清肺消炎丸(批号:5230077、5230098、7870008),由天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂制造；牛蒡子苷、牛蒡子苷元、绿原酸标准品,一方科技有限公司生产；糊精淀粉混合物,Germany公司生产；乙腈、甲醇为色谱纯,磷酸为分析纯,天津康科德科技有限公司生产；超纯水。

1.2色谱条件

色谱柱为Symmetry© C18柱(250×4.6 mm,5 μm),柱温设为25℃。牛蒡子苷和牛蒡子苷元的流动相为甲醇-水(体积比为50∶50),流速1.0 mL/min,检测波长为280 nm；绿原酸的流动相为乙腈-0.4%磷酸(体积比为13:87),检测波长为327 nm。

1.3溶液的制备

1.3.1对照品溶液的制备

精密称取牛蒡子苷、牛蒡子苷元、绿原酸对照品适量,溶于适量甲醇中,配制成每1 mL含牛蒡子苷0.97 mg对照品溶液、含牛蒡子苷元0.10 mg对照品溶液、含绿原酸0.025 mg的对照品溶液。

1.3.2供试品溶液的制备

取1 g清肺消炎丸于研钵中,充分研碎后溶于10 mL甲醇,超声溶解20 min,过0.22 μm微孔滤膜,放入-20 ℃的冰箱中冷冻24 h,析出滴丸辅料聚乙二醇(PEG),13 000 r/min条件下离心10 min,取上清液。

1.3.3空白样品溶液的制备

取1 g糊精淀粉混合物,按照1.3.2节的操作步骤制备空白样品.

2　方法考察

2.1专属性考察

为考察方法的专属性,按照上述色谱条件,取供试品与对照品溶液,进样量为10 μL,注入HPLC系统进行分析。样品及3种对照品的色谱图见图1(图1中t为保留时间，I为吸收强度),牛蒡子苷、牛蒡子苷元和绿原酸对照品的保留时间分别为6.907、16.007 min和9.300 min,样品中3种物质的保留时间依次为6.860、16.100 min和9.327 min。从该实验结果可见方法专属性良好。

图1　样品(A、C)、绿原酸对照品(B)、牛蒡苷对照品(D)、牛蒡苷元对照品(E)色谱图

2.2线性关系考察

分别精密称取3种对照品溶液(牛蒡子苷0.97g/L、牛蒡子苷元0.10 g/L、绿原酸0.025 g/L)2、4、6、8、10 μL进样,每个进样量各3针,分别记录峰面积。以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,做标准曲线。得回归方程:牛蒡子苷为y=7.343 6x+2.350 4,r=0.999 4；牛蒡子苷元为y=18.824x+0.081 6,r=0.999 7；绿原酸为y=51.539x+0.504 9,r=0.999 1。结果表明,牛蒡子苷进样量在1.94～9.70 μg范围内、牛蒡子苷元进样量在0.20～1.00 μg范围内、绿原酸进样量在0.05～0.25 μg范围内与峰面积呈现较好的线性关系。

2.3精密度考察

按照上述色谱条件,取10 μL进样,重复进样5针,测定各自峰面积值。牛蒡子苷的相对标准偏差(RSD)为1.33%(测量次数n=5),牛蒡子苷元RSD为0.84%(n=5),绿原酸RSD为1.96%(n=5)。结果表明该实验方法及仪器的精密度良好。

2.4稳定性考察

取同一批次供试品溶液(批次为5230098),依次于0、2、4、6、8 h后进样10 μL,分别测定牛蒡子苷、牛蒡子苷元和绿原酸的峰面积。得到牛蒡子苷的RSD为1.44%、牛蒡子苷元RSD为0.91%、绿原酸RSD为2.67%。可见样品溶液中牛蒡子苷、牛蒡子苷元和绿原酸在8 h内稳定性良好。

2.5重复性考察

取同一批次清肺消炎丸(批次为5230098),按照2.2节的步骤平行制备5份供试品溶液,分别测定牛蒡子苷、牛蒡子苷元和绿原酸的峰面积。得到牛蒡子苷RSD为0.24%(n=5),牛蒡子苷元RSD为0.97%(n=5),绿原酸RSD为1.50%(n=5)。结果表明实验方法及仪器的重复性良好。

2.6加样回收实验

取空白样品溶液共15份(样品中无牛蒡子苷、牛蒡子苷元和绿原酸),每份500 μL,5份加入0.97 g/L牛蒡子苷对照品溶液500 μL,另5份加入0.10 g/L牛蒡子苷元对照品溶液500 μL,另5份加入0.025 g/L绿原酸对照品溶液500 μL,混合均匀后,各取10 μL进样,测定峰面积值,计算加样回收率,结果见表1。牛蒡子苷回收率为98.33%,RSD=1.69%(n=5)；牛蒡子苷元回收率为102.59%,RSD=1.62%(n=5)；绿原酸回收率为98.17%,RSD=0.98%(n=5)。

表1　回收率实验结果

2.7实际样品检测

取3批清肺消炎丸,按照1.3.2节的步骤制备供试品溶液,按照上述色谱条件,牛蒡子苷和牛蒡子苷元的进样量为12 μL,绿原酸的进样量为20 μL,每批重复进样3次,测定峰面积值,代入各回归方程,计算各批次清肺消炎丸中牛蒡子苷、牛蒡子苷元和绿原酸的含量,结果见表2。

表2　样品检测结果

2.8特征图谱相似度评价

将表2中样品检测所得9组数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行相似度评价,得特征谱图见图2,相似度评价结果分别见表3和表4。三批样品共9组,相似度均大于0.88,可见这三批清肺消炎丸的质量比较稳定。

图2　三批清肺消炎丸特征图谱

批号523007752300775230077523009852300985230098787000978700097870009R52300770．9110．8860．8970．8900．8970．8850．8840．8830．90852300770．9110．9930．9940．9900．9940．9920．9900．9890．99652300770．8860．9930．9920．9980．9930．9990．9990．9990．99852300980．8970．9940．9920．9950．9990．9930．9900．9890．99652300980．8900．9900．9980．9950．9960．9980．9970．9970．99852300980．8970．9940．9930．9990．9960．9950．9900．9910．99778700090．8850．9920．9990．9930．9980．9950．9980．9980．99878700090．8840．9900．9990．9900．9970．9900．9981．0000．99778700090．8830．9890．9990．9890．9970．9910．9981．0000．997R0．9080．9960．9980．9960．9980．9970．9980．9970．997

表4牛蒡苷和牛蒡苷元测定特征图谱相似度评价结果

批号523007752300775230077523009852300985230098787000978700097870009R52300770．9120．9160．9120．9120．9070．9150．9130．9130．9352300770．9120．9840．9820．9980．9960．9850．9850．9860．99352300770．9160．9840．9920．980．9790．9940．9940．9940．99452300980．9120．9820．9920．9820．9810．9970．9970．9980．99552300980．9120．9980．980．9820．9960．9850．9850．9850．99252300980．9070．9960．9790．9810．9960．9840．9840．9850．99278700090．9150．9850．9940．9970．9850．9841．0000．9990．99778700090．9130．9850．9940．9970．9850．9841．0000．9990．99778700090．9130．9860．9940．9980．9850．9850．9990．9990．997R0．930．9930．9940．9950．9920．9920．9970．9970．997

3　结果与讨论

3.1注意事项

由于绿原酸的不稳定性,实验过程中应尽量避光、避热,且尽可能用时现配,并用棕色瓶保存[11]。

3.2波长的确定

根据文献[12]报道,牛蒡子苷元和牛蒡子苷在280 nm波长下进行检测时,所得图谱清晰、特征性好、吸收峰面积大,预实验中也证实在该波长下牛蒡子苷、牛蒡子苷元的出峰情况良好,故采用该波长。文献[13—14]中报道绿原酸在324 nm和327 nm波长处都有较强的吸收峰,根据实验比较发现,等量绿原酸注入HPLC系统后,采用327 nm为波长使吸收峰更大一些,故选用327 nm。

3.3流动相的选择

查阅文献发现,牛蒡子苷及牛蒡子苷元的流动相采用一定比例的甲醇-水效果良好,但比例差别比较大。本实验对比了不同比例的甲醇-水作为流动相的出峰情况,发现当甲醇与水的体积比为1∶1时,牛蒡子苷和牛蒡子苷元分别在6.9 min和16 min左右出峰,且样品中两种物质分离度良好,故采用甲醇-水(体积比为1∶1)作为检测牛蒡子苷和牛蒡子苷元的流动相。由于绿原酸在牛蒡子苷及牛蒡子苷元的条件下出峰效果不理想,故根据文献采用乙腈-0.4%的磷酸水(体积比为13∶87)作为测定绿原酸含量的流动相,实验证明效果良好。

4　结语

牛蒡子是清肺消炎丸的重要组成成分,具有驱热、宣肺、利咽、消肿等生理功能[15]。牛蒡子中含有木脂素类、萜类、挥发油和脂肪酸、酚酸衍生物等多种化学成分,其中对抗炎作用起主要贡献的包括牛蒡子苷元、牛蒡子苷等木脂素类化合物以及绿原酸等酚酸衍生物。程彬峰等[16]对清肺消炎丸的抗炎机制进行了研究,从中共鉴定了包括牛蒡苷、绿原酸在内的55种化合物,并认为主要有木脂素类、酚酸类、类固醇和硫炔类作用于炎症反应的9条不同通路从而参与清肺消炎丸的抗炎作用。研究表明,牛蒡子苷在人体内分解为牛蒡子苷元发挥抗炎作用,而牛蒡子苷元可能是通过调节免疫应答对活化巨噬细胞、淋巴细胞包括TNF-α、NO产生及淋巴细胞增殖起到抗炎作用；绿原酸则是通过抑制COX-2、NF-κBp65发挥抗炎作用。因此,清肺消炎丸中抗炎成分的抗炎机制是多重的。

在药物的生产过程中需要对牛蒡子的质量进行严格的控制,进而控制牛蒡子苷、牛蒡子苷元和绿原酸的含量,以在最适合的剂量下发挥最佳抗炎效果。根据上述实验数据可知,本文具有专属性高、精确性好、重复性好等特点,且操作简单、便捷,可快速对清肺消炎丸中这3种物质的含量进行定量分析,为清肺消炎丸和牛蒡子的质量控制提供了依据。

致谢：在项目完成的过程中,感谢南开大学设备处的胡宁老师,徐召老师对相关仪器设备的大力支持和帮助。

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Determination of content of three anti-inflammatory ingredients in Qingfei Xiaoyan Wan by using HPLC method

Cui Qingxin, Liao Chengmei, Chen Zhikai, Ma Fang, Tao Jin

(College of Pharmacy,Nankai University,Tianjin 300071,China)

By using the method of high performance liquid chromatography (HPLC) to quantitatively determine the content of arctii,arctigenin and chlorogenic acid in Qingfei Xiaoyan Wan.The chromatographic column is Symmetry© C18 color table. The mobile phase for arctii and arctigenin is methanol-water (50:50),the detection wavelength is 280 nm; for the chlorogenic acid was acetonitrile-0.4% phosphoric acid (13:87),the detection wavelength is 327 nm. The contents of arctii,arctigenin and chlorogenic acid were 4.07 mg/g(n=3),0.19 mg/g (n=3) and 0.076 mg/g(n=3)respectively in Qingfei Xiaoyan Wan. It shows that there is a good linear relationship between the peak area and sample size of arctii,arctigenin and chlorogenic in the range of 1.94-9.70 μg,0.20-1.00 μg and 0.05-0.25 μg, respectively. The recovery rates were arctii 102.59% (RSD=1.69%,n=5),arctigenin 98.17 %( RSD=1.52%,n=5) and chlorogenic acid 98.33% (RSD=1.46%,n=5). The method used in this study is simple,accurate,sensitive, and has strong specificity and good repeatability. And it can be used to quantitatively determine the content of the material in Qingfei Xiaoyan Wan.

qingfei xiaoyan wan; arctiin; arctigenin; chlorogenic acid；HPLC

10.16791/j.cnki.sjg.2016.10.015

2016-04-22修改日期：2016-05-23

国家自然科学基金项目 (81503214, 81173638)

崔庆新(1982—)，男,山东泰安，博士，实验师，研究方向为药物分析.E-mail：cuiqingxin@nankai.edu.cn

R284.1

A

1002-4956(2016)10-0055-04