合浦珠母贝糖胺聚糖的分离纯化及理化性质分析

周小双,王锦旭,杨贤庆,*,林婉玲,魏　涯

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)



合浦珠母贝糖胺聚糖的分离纯化及理化性质分析

周小双1,2,王锦旭1,杨贤庆1,*,林婉玲1,魏涯1

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

研究合浦珠母贝糖胺聚糖粗品经分离纯化得到的精制品的理化性质,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定样品分离情况,并对样品进行红外分析。经枯草杆菌蛋白酶与胰蛋白酶双酶酶解提取糖胺聚糖粗制品后,将粗制品利用DEAE-52离子交换柱进行纯化,纯化时分别用0.5 mol/L NaAc(pH=6.0)和1.5 mol/L NaCl进行洗脱,得到精制品GAG1和GAG2。利用苯酚-硫酸法、Bradford法、明胶-氯化钡法、Orcinol法、Wagner法、红外光谱法分析GAG1和GAG2的理化性质。通过各实验结果,可以初步猜测GAG1为肝素钠,GAG2为硫酸软骨素。

合浦珠母贝,糖胺聚糖,纯化,理化性质

合浦珠母贝(Pinctadamartensii)是莺蛤目莺蛤科真珠蛤属的一种,亦称“马氏珠母贝”。自我国成功开展其人工育苗,海水珍珠养殖业开始迅猛发展[1]。目前合浦珠母贝是我国海水养殖贝的主要种类[2]。近几年合浦珠母贝的研究主要集中于遗传育种、珍珠层结构、插核育珠等[3],而针对软体部贝肉的研究不多。合浦珠母贝贝肉的每年产量很大,而且贝肉中含有多种活性成分如糖胺聚糖,如果对其加以研究利用,相信一定会有很好的应用前景。

糖胺聚糖(glycosaminoglycan),又称氨基多糖、酸性粘多糖,是酸性多糖的一种,主要存在高等动物组织中。糖胺聚糖是由重复的二糖单位氨基己糖和己糖醛酸构成的长链多糖。目前已经确定的糖胺聚糖结构是硫酸软骨素C(CSC)、硫酸软骨素A(CSA)、透明质酸(HA)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)、肝素(HP)及硫酸乙酰肝素(HS)[4]。不同动物中糖胺聚糖存在差异,虽然已有学者对翡翠贻贝[5]、近江牡蛎[6]、波纹巴非蛤[7]、四角蛤蜊[8]等多种贝类糖胺聚糖进行了研究,但合浦珠母贝还没有较全面的研究。

本实验主要研究合浦珠母贝糖胺聚糖粗制品的分离纯化及分析精制品的理化性质,观察其结构特征,旨在进一步研究其生物活性并将其应用于保健品,高值化利用合浦珠母贝贝肉,促进珍珠产业的可持续发展。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

糖胺聚糖粗制品前期从合浦珠母贝的全脏器中通过酶解法提取,经1,9-二甲基亚甲基蓝法检测后保存备用;1,9-二甲基亚甲基蓝购自Sigma;甘氨酸、NaCl、NaAc、氯仿、正丁醇、无水乙醇均为分析纯,购自齐云生物科技。

Milli-Q超纯水机、小型切向流超滤系统美国MILLIPORE;J26XP高速离心机美国贝克曼库特;紫外可见分光光度计日本SHIMADZU;Alpha1-4冷冻干燥机德国Christ;GM-0.33B隔膜真空泵;TLJ-2型定时增力电动搅拌器姜堰市天力医疗器械有限公司;CBS-B程控多功能全自动部份收集器和BT-100SD定时电脑泵上海青浦沪西仪器厂;Powetpac@Basic基础电泳仪美国Bio-rad;IRAffinity-1型红外光谱仪岛津SHINADZU。

1.2实验方法

1.2.1糖胺聚糖粗制品分离纯化

1.2.1.1DEAE-52填料的处理将DEAE-52填料在0.5 mol/L的NaOH溶液中浸泡30 min,用蒸馏水洗涤至中性;用0.5 mol/L 的HCl浸泡填料30 min,用蒸馏水洗涤至pH7.0;最后再用0.5 mol/L的NaOH溶液中浸泡30 min,用蒸馏水洗涤至pH7.0。向填料中加10倍体积的缓冲液(0.5 mol/L NaAc,pH6.0)浸泡过夜,倾倒出上层悬浮颗粒。缓慢搅拌均匀,通过玻璃棒引流将填料缓慢注入50 cm×4 cm的离子交换柱中,在灌注过程中可以将柱子与恒流泵连接使用0.5 mol/L NaAc(pH6.0)进行缓慢压柱,然后不断补充填料重复压柱直到上方留有10 cm左右的空隙,最后用0.5 mol/L NaAc(pH6.0)洗涤柱子2个柱床体积,使柱子平衡[6]。

1.2.1.2分离柱:DEAE-52-纤维素离子交换柱(4 cm×50 cm)。流速:10 mL/h,180滴/管,每管5 mL。进样量:50.0 mL,进样浓度:30 mg/mL。检测方法:1,9-二甲基亚甲基蓝法[9-10],洗脱液:pH6.0的0.5 mol/L NaAc缓冲液和0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L氯化钠溶液各600 mL进行阶段洗脱。通过绘制洗脱曲线,根据曲线峰型将构成同一峰的各管收集在一起,由此确定最佳洗脱液组合。将溶液收集后透析除盐、超滤浓缩(截留分子量5 ku)、真空冷冻干燥。

1.2.2各成分测定总糖含量测定:苯酚-硫酸法(标准品为无水葡萄糖)[11];蛋白质含量测定:Bradford法(标准品为5 mg/mL蛋白溶液);糖醛酸含量的测定:Orcinol法(标准品为D-葡萄糖醛酸)[4];硫酸基含量的测定:明胶-氯化钡法(标准品为无水硫酸钾)[12];氨基己糖含量测定:Wagner法(标准品为氨基葡萄糖盐酸盐)[13]。

1.2.3琼脂糖凝胶电泳以0.5%琼脂糖溶液制成8.8 cm×6.5 cm胶板,缓冲系统为巴比妥钠缓冲液(0.05 mol·L-1,pH8.5),恒压80 V电泳,至指示剂(甲酚红)距原点3.5 cm(约40 min)关闭电泳仪,取下胶板在固定液(0.1%十六烷基三甲基溴化铵)中固定60 min,将固定液回收,胶板于70 ℃烘干,0.1%甲苯胺蓝溶液(用醋酸∶乙醇∶水=0.1∶5∶5,V/V 配制)染色2 h,用适量脱色液(醋酸∶乙醇∶水=0.1∶5∶5,V/V)进行脱色4 h后,再用去离子水洗至背景无色,通过观察电泳图中的谱带分布情况,以此确定样品分离纯化的效果。

1.2.4红外光谱分析采用溴化钾压片法,取一定量的干燥溴化钾粉末进行研磨,取适量研磨后的粉末研制成透明薄片作为背景样品,在剩余的溴化钾粉末中加入约0.5 mg样品进行研磨混合均匀后,同样研制成透明薄片,在IRAffinity-1型红外光谱仪中进行测定。红外光谱仪测定参数:背景扫描次数32次;扫描范围400～4000 cm-1;分辨率4.0 cm-1;检测器:带温度控制系统的DLATGS检测器。

2　结果与分析

2.1分离纯化

利用1,9-二甲基亚甲基蓝法测定双号管中溶液的吸光度值,通过测定结果发现只有0.5 mol/L NaAc(pH6.0)及1.5 mol/L NaCl两种洗脱液洗下的溶液中含有糖胺聚糖。在后面的纯化实验中只需使用这两种洗脱液,洗脱曲线见图1。根据曲线峰型收集样品的各部位(峰1为GAG1,峰2为GAG2),将收集的洗脱液分别透析脱盐、超滤浓缩、冷冻干燥。

图1　DEAE-52梯度洗脱曲线Fig.1　DEAE-52 gradient elution curve

2.2各成分分析

2.2.1各指标分析方法标准曲线利用苯酚-硫酸法、Bradford法、Orcinol法、明胶-氯化钡法、Wagner法分别测定样品GAG1、GAG2中总糖、蛋白质、己糖醛酸、硫酸基、氨基己糖的含量,得线性回归方程见表1。

表1　各分析方法的标准曲线

2.2.2各组分成分测定结果分离纯化所得到的组分GAG1、GAG2的成分分析见表2,从结果可以看出GAG1、GAG2是聚阴离子多糖,其中的阴离子主要是己糖醛酸和硫酸基,GAG2中硫酸基含量高于GAG1,显示GAG2具有较强的生物活性,对于样品中可能存在的其他组分还有待进一步研究。对于样品成分分析为研究结构、活性和综合利用提供了必要信息。

表2　各组分成分分析结果(%)

2.3琼脂糖电泳

不连续的琼脂糖凝胶电泳在糖胺聚糖分离纯化的过程中发挥重要作用,可用于区分可能发生的部分降解而造成的结构变化。本实验采用碱性琼脂糖凝胶电泳,酸性多糖可以泳动并特异性染色。合浦珠母贝糖胺聚糖为聚阴离子多糖,糖链上阴离子基团的类别、多少和连接位置的差别,都可能使它们在电泳中的迁移率不同,从而通过谱带表现出来。图2为样品的琼脂糖凝胶电泳图,其中谱带依次为GAG2、GAG1、糖胺聚糖粗品,糖胺聚糖粗品的电泳图为两个谱带,GAG2与糖胺聚糖粗品快带的电泳特性相同,GAG1与其慢带的电泳特性相同,说明通过DEAE-52离子交换柱将粗品有效分离,其中GAG2染色较深,说明其酸性较大。

图2　琼脂糖凝胶电泳Fig.2　Agarose gel electrophoresis

2.4红外光谱分析结果

GAG1在3419.80 cm-1处具有强宽吸收峰,说明含有-OH的O-H键和-N-H2的N-H键伸缩振动。2933.73 cm-1左右处具有弱的吸收峰,为有-CH或CH3的C-H键伸缩振动,说明含有糖类饱和C-H键;1651.07、1558.48 cm-1左右处具有强吸收峰,说明有-NHCOCH3-存在;1411.89 cm-1处具有强吸收峰,为羧基C=O对称伸缩振动;1242.16 cm-1处有强吸收峰为S=O伸缩振动;1045.42 cm-1处强吸收峰为C-O伸缩振动;从图谱的红外吸收波数分析可知,以上描述均符合肝素钠的光谱特征[14],可以初步猜测GAG1为肝素钠。

图3　GAG1的红外光谱图 Fig.3　IR spectrum of GAG1

GAG2在3410.15 cm-1处具有强宽吸收峰,说明含有-OH的O-H键和-N-H2的N-H键伸缩振动。2937.59 cm-1左右处具有弱的吸收峰,为有-CH或CH3的C-H键伸缩振动,说明含有糖类饱和C-H键;1658.78、1552.70 cm-1左右处具有强吸收峰,说明有-NHCOCH3-存在;1500～1250 cm-1之间有三个弱吸收峰;1242.16 cm-1处有强吸收峰为S=O伸缩振动;1049.28 cm-1处强吸收峰为C-O伸缩振动;从图谱的红外吸收波数分析可知,以上描述均符合硫酸软骨素的光谱特征[15],可以初步猜测GAG2为硫酸软骨素。

图4　GAG2的红外光谱图Fig.4　IR spectrum of GAG2

3　结论

糖胺聚糖粗品经DEAE-52柱分离纯化后得到两个组分(GAG1、GAG2),GAG1、GAG2中都含有氨基己糖、己糖醛酸、硫酸基,其中GAG2的己糖醛酸、硫酸基的含量大于GAG1。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定发现经过纯化后得到的两个组分为均一成分,而且GAG2的酸性要大于GAG1。从红外分析结果来看,GAG1、GAG2中含有-OH的O-H键、-N-H2的N-H键伸缩振动、-NHCOCH3-、S=O 伸缩振动等特征基团,这些都符合糖胺聚糖的结构特征,其中GAG2在1500～1250 cm-1之间有三个弱吸收峰。综合以上数据,可以初步猜测GAG1为肝素钠、GAG2为硫酸软骨素。接下来的实验可以对两组分的结构进行进一步验证研究,为后续的活性研究奠定基础。

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Purification and physicochemical characteristics of glycosaminoglycan fromPinctadamartensii

ZHOU Xiao-shuang1,2,WANG Jin-xu1,YANG Xian-qing1,*,LIN Wan-ling1,WEI Ya1

(1.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,National R&D Center for Aquatic Product Processing,Guangzhou 510300,China;2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

This paper studied on purification and physicochemical characteristics of glycosaminoglycan fromPinctadamartensii. The separation of the samples was identified by agarose gel electrophoresis and analyzed by infrared spectroscopy. After glycosaminoglycan was achieved from the whole viscera ofPinctadamartensiivia enzymatic hydrolysis by pancreatin and neutral protease ofBacillussubtilis,the crude glycosaminoglycan was purified by DEAE-52 ion exchange column with 0.5 mol/L NaAc(pH=6.0)and 1.5 mol/L NaCl,then the purified product of glycosaminoglycan(GAG1and GAG2)were obtained. The physicochemical properties of the purified product were analyzed by the method of phenol-sulfuric acid,Bradford,Orcinol,Wagner,Infrared spectroscopy. The results showed that GAG1was heparin sodium and GAG2was chondroitin sulfate.

Pinctadamartensii;glycosaminoglycan;purification;physicochemical characteristics

2016-01-18

周小双(1991-),女,硕士研究生,研究方向:水产品加工与质量安全,E-mail:zxiao_shuang@163.com。

杨贤庆(1963-),男,研究员,研究方向:水产品加工与质量安全,E-mail:yxqgd@163.com。

广东省自然科学基金项目(2016A030313144);广东省公益研究与能力建设专项(2014A020217009);广东省海洋渔业科技与产业发展专项科技攻关与研发项目(A201501C08);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2014TS25);农业部水产品加工重点实验室开放基金项目(NYBJG201408)资助。

TS254.1

A

1002-0306(2016)16-0127-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.17