离子色谱-氢化物发生-原子荧光光谱(IC-HG-AFS)联用技术检测胶州湾海产品中硒的赋存形态

韩婷婷,崔　鹤,宋　田,姬泓巍,李慧新,朱倩林,蔡　峰,张　涛

(1.中国海洋大学化学化工学院,山东青岛 266100;2.山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,山东青岛 266002;3.燕山大学理学院,河北秦皇岛 066004)



离子色谱-氢化物发生-原子荧光光谱(IC-HG-AFS)联用技术检测胶州湾海产品中硒的赋存形态

韩婷婷1,2,崔鹤2,*,宋田3,姬泓巍1,李慧新2,朱倩林1,蔡峰2,张涛2

(1.中国海洋大学化学化工学院,山东青岛 266100;2.山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,山东青岛 266002;3.燕山大学理学院,河北秦皇岛 066004)

建立了离子色谱-氢化物发生-原子荧光光谱联用技术(IC-HG-AFS)测定胶州湾海产品中4种硒形态的方法。研究了色谱柱、流动相、提取剂、提取温度及其仪器条件等对硒荧光信号值的影响。试样用1.5 mol/L的氢氧化钾溶液作提取液,采用AS11-HC(250 mm×4.1 mm,5.0 μm)阴离子色谱柱,20 mmol/L碳酸氢钠溶液/2%乙腈为流动相,1.0 mL/min流速,可在8 min内同时分离检测硒代胱氨酸(SeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、亚硒酸根Se(Ⅳ)和硒酸根Se(Ⅵ)。当4种形态的质量浓度范围为 0～100 μg/L时,各形态均得到良好的线性关系,线性相关系数均大于0.996,各形态的检出限分别为SeCys 1. 53 μg/L,SeMet 1.72 μg/L,Se(Ⅳ)0.30 μg/L,Se(Ⅵ)1.06 μg/L，相对标准偏差RSD均小5%(n=6),在最佳条件下,应用该方法测定了水产品中的硒形态,4种硒形态化合物加标回收率在86.1%～105.3%之间。该方法测定海产品中的硒形态准确、可靠、简便灵敏,为科学有效地评价海产品质量和开展风险评估提供技术支撑。

离子色谱,氢化物发生原子荧光,胶州湾,海产品,硒形态

硒是生命活动中必须的微量元素之一,在动物体内硒蛋白含量有20多种,而海洋生物中硒蛋白含量较多[1]。硒的主要作用是参与生物体内酶的合成,其生物化学功能主要取决于硒蛋白含量,具有增强免疫力、抗衰老和预防多种疾病的作用[2],但过量摄入将会导致硒中毒。硒的形态可分为有机硒和无机硒两大部分,有机硒存在于氨基酸结构中,主要有硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸等,这些有机硒对人体是有益的,硒代蛋氨酸是人类摄取硒元素的主要来源[3]。无机硒主要包括亚硒酸盐和硒酸盐,亚硒酸根毒性最强,硒酸根次之,从生物功能方面来讲,Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)会导致生物体病变。因此,富硒食品尤其是对某种有机硒形态有目的的补充,对保持身体健康具有重要意义。

传统的元素分析技术主要有电分析法、光谱分析法和色谱分析法[4]。电分析法由于耗时耗力,极易引入污染而限制了其应用。光谱分析法分为分子光谱法和原子光谱法,该方法是分子中价电子在基态-激发态之间跃迁吸收或释放特定的电离能实现待测物质的检测,在形态分析方面应用较为广泛。色谱分析法按照流动相的状态可分为液相色谱、气相色谱和质谱,在色谱技术发展过程中色谱分析法着重解决元素分离问题,而大多数元素的化合形态并不能用色谱检测器得到较高灵敏度[5]。因此,色谱技术单独作为分离技术与其他高灵敏度的检测器联用成为元素形态分析发展的新趋势。

联用技术集高效分离与高灵敏度检测技术于一体,目前已有的联机类型主要有IC-ICP-MS、HPLC-AFS、HPLC-OES等,其中离子色谱与高效液相色谱相比在流动相的使用上具有更加环保、污染低的优势,且试用范围更为广泛。原子荧光光谱仪凭借其成本低、检出限低、灵敏度高等优势而被广泛应用[6-9],故本文选择IC-AFS联机技术来测海产品中硒形态。对于硒形态的研究就前处理方面多采用Tris-HCl、酸、酶等提取剂,但由于酸具有腐蚀性、Tris-HCl的致癌性、酶的提取效率对有机硒更准确对无机硒提取一般等缺陷[10-13],建立一个成熟、准确、有效的硒形态的分析方法已成为迫切需求。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

舌头鱼、扇贝、海带、海红、黄尖子鱼、秋刀鱼、带鱼、鲅鱼、虾、墨鱼、章鱼、鲭鱼均为青岛胶州湾不同季节海产品;硝酸(GR)、盐酸(GR)、乙酸(AR)、硼氢化钾(AR)、碘化钾(GR)、氢氧化钾(AR)、碳酸氢钠(AR)均购买自国药集团药业股份有限公司;乙腈HPLC,德国默克公司;硒酸根标准溶液物质(GBW10033)、亚硒酸根标准溶液物质(GBW10032)、硒代蛋氨酸标准溶液物质(GBW10034)、硒代胱氨酸标准溶液物质(GBW08669)均购买自中国计量科学研究院;水为重蒸水(Millipore装置纯化后使用);0.22 μm微孔滤膜天津科技发展有限公司。

AFS-9130型原子荧光光谱北京吉天仪器有限公司;SA-20型原子荧光形态分析仪北京吉天仪器有限公司;CIC-160型离子色谱仪青岛盛瀚色谱技术有限公司;AS11自动进样器青岛盛瀚色谱技术有限公司;Milli-Q去离子水制备装置赛默飞世尔科技公司;AS11-HC分离柱赛默飞世尔科技公司;AG11-HC保护柱赛默飞世尔科技公司;原子荧光空心阴极灯;MS 3 basic混旋仪IKA集团;Terminal 740(pH电极,SenTix-41);散射式浑浊度仪德国WTW公司;KQ-500DE型数控超声波清洗仪昆山市超声仪器有限公司;TGL-20B离心机上海安亭科学仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1离子色谱条件色谱柱为AS11-HC分离柱(250 mm×4.1 mm,5.0 μm);流动相为20 mmol/L碳酸氢钠溶液/2%乙腈;流速为1.0 mL/min;25 μL定量环。

1.2.2氢化物发生条件载流:8% HNO3溶液;氧化剂:3.5 g/L KOH和1.5 g/L KI;还原剂:3.5 g/L KOH和20 g/L KBH4;间隔气:空气;泵速:80 r/min;紫外灯(UV):开。

1.2.3AFS的仪器参数硒灯总电流:90 mA;光电倍增管负高压:300 V;屏蔽气流量:800 mL/min;载气流量:400 mL/min。

1.2.4标准溶液的制备Se(IV)、Se(VI)、SeCys、SeMet标准储备液均为2 mL,分别移取相应量的4种标准储备液稀释得到2 mg/L的混合标准溶液储备液,放置于4 ℃冰箱中保存备用。分别取2 mg/L的混合标准逐级稀释成5.0、20、40、80、100 μg/L的标准使用液,现配现用。

1.2.5前处理方法称取经粉碎混合均匀的样品1.00 g(精确至0.001 g)于50 mL离心管中,加入10 mL 1.5 mol/L氢氧化钾溶液,涡旋振荡混匀后,70 ℃超声1.5 h,静置冷却后加入甲酸调节pH=12～13,加水定容至25 mL,5000 r/min离心10 min,上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤,待上机测定。

1.2.6提取率的计算提取率(%)=试样经恒温超声浸提1.5 h各种形态硒含量的总和/现行国标试样经酸消解后测得的总硒含量的比值×100[14]。

2　结果与讨论

2.1色谱条件选择

2.1.1色谱柱的选择实验过程中分别对Agilent ZORBAX SB-C8液相柱、Hamilton PRP-X100液相柱以及AS11-HC色谱柱的分离效果进行了探索,其中Agilent ZORBAX SB-C8色谱柱,以二次水做流动相Se(Ⅳ)、SeCys、Se(Ⅵ)在6 min内可全部出峰,SeMet未出峰,后用磷酸氢二铵/1 mol/L十六烷基三甲基溴化铵/2%乙腈作流动相,并调节其pH,但SeMet仍未出峰。用Hamilton PRP-X100色谱柱,以30 mmol/L磷酸二氢铵为流动相SeCys、Se(Ⅵ)将出现重叠现象,当调节流动相pH=6时,Se(Ⅵ)的色谱峰可出现一半,分离效果不理想。最终选择AS11-HC色谱柱,用20 mmol/L碳酸氢钠溶液/2%乙腈做流动相,并将流动相pH调节至12～13之间,此时SeMet、Se(Ⅳ)、SeCys、Se(Ⅵ)四种形态可在7 min中内依次全部出峰(图1),并且分离效果较好,故最终选择AS11-HC色谱柱。

图1　AS11-HC色谱柱分离硒形态混合标准谱图Fig.1　Chromatogram of mix standard with AS11-HC column

2.1.2流动相的选择在选用AS11-HC色谱柱后,分别NaOH和NaHCO3作为流动相考察了不同流动相对硒形态分离的影响。选用氢氧化钠做流动相,4种硒形态不能完全分离,最终选择碳酸氢钠作为流动相,并在流动相中加入适量乙腈以提高增敏效果,改变流动相浓度(20～40 mmol/L)和流速(0.6～1.0 mL/min)来考察流动相浓度和流速对分离度和荧光信号的影响,当选用20 mmol/L碳酸氢钠溶液/2%乙腈并调节pH=12～13时,硒的4种形态可在7 min中内完成分离,且分离效果较好。

2.2仪器工作条件

2.2.1氧化剂载流还原剂当使用K2S2O8和KOH作为氧化剂时,不会得到Se(VI)的谱图,当用3.5 g/L KOH和1.5 g/L KI作氧化剂时,硒的4种形态可得到完全分离。还原剂当选用3.5 g/L KOH和 20 g/L KBH4时,荧光信号较3.5 g/L KOH和 10 g/L KBH4更强(图2),故选用20 g/L KBH4。改变载流浓度(6%,8%,10%),对于SeMet、SeCys、Se(VI)三种形态的荧光信号影响不大,但Se(IV)的荧光信号由高到低依次是8%>6%>10%,因此应选择荧光信号较高时8%硝酸溶液作为载流以得到更高的灵敏度。

图2　不同浓度硼氢化钾的硒形态混合标准谱图Fig.2　Chromatogram of mix standard with different concentration of KBH4

2.2.2载气和屏蔽气流速氩气作为载气和屏蔽气在原子荧光检测中是不可或缺的,氩气的流量影响着测定效果,载气流量小会因氩氢火焰的不稳定影响结果的重现性,载气流量过大则会稀释原子蒸气,降低荧光信号。屏蔽气的作用是保持氩氢火焰的稳定,防止原子化器中样品气体被空气氧化,气流小时信号稳定,综合考虑,最终选择载气流速为400 mL/min,屏蔽气流速为800 mL/min。

2.2.3灯电流和负高压原子荧光元素灯电流的大小将会决定激发光源的发射强度,所以一定范围内随着灯电流的增加,其荧光强度也会相应增加,但灯电流太高将发生自吸效应,使基线噪声增加,此外也将减少灯的使用寿命。现通过控制变量法对灯电流进行60、70、80、90、100 mA一系列的讨论,60、70、80 mA的荧光强度较低,而100 mA的荧光强度与90 mA的荧光强度相差无几,但100 mA的基线噪声高,故最终选择元素灯的灯电流为90 mA。负高压将直接影响信号的放大倍数,随着负高压的加大荧光信号也将增强,但同时也会使背景和噪声增加。因此,负高压也需要进行讨论筛选,最终将负高压定为300 mA。

2.2.4原子化器高度原子化器高度决定了检测时原子化器的温度,而原子化器温度又决定了气态氢化物转化为基态原子的效率。因此,原子化器越高转化效率越高,但相应的检出限会越低。实验通过将原子化器高度进行7、8、9、10 mm一系列的调节,当调节至9、10 mm时虽然稳定性高,基线噪声小,但检出限也相应降低,对于硒微量元素而言,将会直接影响样品的检测。当为7 mm时的谱图背景和噪声已超出检测所能承受的范围,故将原子化器高度定至8 mm。

2.2.5蠕动泵转速泵速的改变会使经色谱柱分离后的硒与还原剂、载流和氧化剂反应的速度发生改变,选取蠕动泵速60、70、80、90 r/min来考察其对结果的影响。泵速越大,氢化反应越完全,其灵敏度也越高,但太大将会使反应不完全,当泵速为90 r/min时,较80 r/min而言,其灵敏度没有明显的提高,且试剂消耗量也较大,容易造成试剂的浪费和环境污染,当泵速在60、70 r/min的灵敏度明显低于80 r/min,综合以上分析选取蠕动泵速为80 r/min。

2.3提取条件的选择

2.3.1提取液对四种硒形态的影响分别选用二次水、1.0 mol/L氢氧化钾溶液、1.5 mol/L氢氧化钾溶液、5 mmol/L柠檬酸溶液、20 mmol/L乙酸铵溶液、0.1 mol/L乙酸溶液、1%盐酸溶液、1%硝酸溶液、1.0 mol/L氢氧化钾溶液/甲醇溶液(5∶1)9种提取液10 mL于50 mL离心管中加入1.00 g带鱼,按照前处理方法(1.2.5)进行实验。结果见表1。

表1　不同提取液对带鱼中硒的提取率

表3　线性范围、线性方程、相关系数和检出限

表4　海产品硒含量及加标回收率(n=6)

由表1可知,在总硒含量均为0.26 mg/kg时加入相同量的不同提取液下,1.5 mol/L氢氧化钾溶液在9种提取液中的提取率最高，1.0 mol/L氢氧化钾溶液次之,少量甲醇溶液的加入并没有得到较高的提取率,而乙酸、乙酸铵、柠檬酸的提取率比二次水还要低,故最终选择1.5 mol/L氢氧化钾溶液作为理想提取液。

2.3.2提取时间为探究提取时间对实验结果的影响,在70 ℃恒温下选定1、1.5、2 h三段提取时间进行实验,结果表明当提取时间为1.5 h时最优,当为1 h时提取效率较低,当为2 h时提取效率与1.5 h相差不大,但耗费时间,故最终选择1.5 h。

2.3.3提取温度分别在不同温度下恒温超声提取,结果见表2。

表2　不同温度下的硒提取率(%)

表2可知,70 ℃恒温超声浸取1.5 h的效果最好,提取效率可达90%以上。

2.4线性范围、检出限和精密度

通过溶解相应量的Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeCys、SeMet 4种2 mg/L标准储备液稀释得到的100 mg/L混合标准溶液储备液,取100 mg/L标准混合工作溶液逐级稀释配制成浓度分别为5.0、20、40、80、100 μg/L的标准工作溶液,按照实验条件从低浓度到高浓度分别注入。结果见表3。

从表3可知,4种形态均呈现很好的线性关系,相关系数均大于0.996。

2.5实际样品的测定

在确定检测方法后,对海带、虾、扇贝、鲅鱼等12种测试对象,进行加标回收率和精密度实验,以考察方法的准确度和重现性。实验中称取1.000 g样品,分别加入0.125、0.25、0.625 mg/kg三个浓度水平,每个浓度平行测定六次,实验结果见表4。墨鱼样品和加标回收实验谱图见图3,用pH=13的二次水配制的标准谱图见图4。

从表4中可知,12种测试样品的平均回收率都在86.1%以上,相对标准偏差小于5%,具有较高的灵敏度和精密度。

图3　墨鱼样品和加标回收实验谱图Fig.3　The spectra of cuttlefish samples and standard addition recovery

图4　pH=13的二次水配制的标准谱图Fig.4　The standard spectra of pH=13 secondary water

3　结论

本文通过对4种硒形态提取率、加标回收率等实验的研究,优化了海产品中硒形态的前处理和仪器条件,建立了以AS11-HC阴离子色谱柱,碳酸氢钠溶液/乙腈为流动相,氢氧化钾溶液作提取液测定海产品中硒形态的方法。该方法线性相关系数均大于0.996,各形态的最低检出限为0.30 μg/L,相对标准偏差RSD均小5%(n=6),测定了12种水产品中4种硒形态化合物,其加标回收率在86.1%～105.3%之间。该方法测定海产品中的硒形态准确、可靠、简便灵敏,为科学评价水产品质量、制定水产品中有毒无机硒限量标准提供了技术支撑和数据支持。

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Selenium speciation analysis in aquatic products of Jiaozhou Bay by ion chromatographic hydride generation-atomic fluorescence spectrometry

HAN Ting-ting1,2,CUI He2,*,SONG Tian3,JI Hong-wei1,LI Hui-xin2,ZHU Qian-lin1,CAI Feng2,ZHANG Tao2

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266100,China;2.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center,Qingdao 266002,China;3.College of Science,Yanshan University,Qinhuangdao 066004,China)

A sensitive analytical method was developed for speciation of aquatic products of Jiaozhou Bay by ion chromatography hydride generation-atomic fluorescence spectrometry(IC-HG-AFS). Learning the mobile phases,extraction reagents,extraction temperature and instrumental conditions was influence for selenium fluorescence signal value. The sample was extracted by the 1.5 mol/L Kalium hydroxide solution. Using the AS11-HC(250 mm×4.1 mm,5.0 μm)anion column,20 mmol/L Sodium hydrogen carbonate solution,2% acetonitrile mobile phase,1.0 mL/min velocity of flow. It could be separated simultaneously in 8 minutes,detecting the Selenocystine(SeCys),Selenomethionine(SeMet),Se(Ⅳ)and Se(Ⅵ). On the optimized conditions,linear relationships between values of fluorescence intensity and mass concentration of selenium species were found in the same range of 0～100 μg/L,with the correlative coefficients more than 0.996. The detection limits(3 s/k)of SeCys,SeMet,Se(Ⅳ),Se(Ⅵ)were 1.53,1.72,0.30,1.06 μg/L,respectively,and the relative standard deviations(n=6)for the selenium species were all less than 5%. Applying the present procedure to the speciation analysis of selenium in aquatic products,the spiked recoveries from 86.1% to 105.3% were obtained. The method for the determination of selenium species in aquatic products was accurate,reliable,simple and sensitive,and effectiveness for the scientific evaluation of the quality of aquatic products and to provide technical support for conduct risk assessments.

ion chromatography;hydride generationatomic fluorescence;Jiaozhou Bay;aquatic products;selenium speciation

2016-03-08

韩婷婷(1992-)，女，硕士，研究方向：仪器分析，E-mail：hantingtingouc@163.com。

崔鹤(1962-)，男，博士，研究员，研究方向：离子色谱开发研究，E-mail：cuihe88@aliyun.com。

国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ090229)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)18-0081-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.007