唾液代谢组学方法对早期牙周炎的快速鉴定

王　辉，库莉博，徐国权，赵志华，马　莉

(1. 唐山职业技术学院 口腔系，河北 唐山 063000；2. 华北理工大学附属医院 口腔科，河北 唐山 063000)



唾液代谢组学方法对早期牙周炎的快速鉴定

王辉1，库莉博1，徐国权2，赵志华1，马莉1

(1. 唐山职业技术学院 口腔系，河北 唐山 063000；2. 华北理工大学附属医院 口腔科，河北 唐山 063000)

目的探讨将基于氢谱核磁共振(1H-NMR)的代谢组学方法应用于牙周炎患者和健康个体鉴定的可行性。方法通过血常规检测选取符合条件的受试者作为试验组和对照组，统计学分析试验组与对照组的基本指标的差异；收集唾液进行核磁共振检测，比较图谱的差异；利用多元统计分析相关数据研究聚类关系。结果统计学分析显示试验组与对照组在白细胞计数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比三个方面无明显差异(P>0.05)。牙周炎患者的图谱与健康个体的图谱比较在δ 3.0～4.0和δ 2.0～2.6区域以及δ 1.0附近的波峰有明显的变化。主成分分析和偏最小二乘判别分析显示，牙周炎患者和健康个体相应的数据内部有集中的聚类关系。结论基于氢谱核磁共振的代谢组学方法可以区分牙周炎患者和健康个体，代谢组学方法有望在早期牙周炎的快速诊断中成为一种新的检测手段。

牙周炎；唾液；代谢组学；核磁共振

[引用本文]王辉，库莉博，徐国权，等.唾液代谢组学方法对早期牙周炎的快速鉴定[J].大连医科大学学报，2016,38(5)：440-443.

牙周炎是牙周组织的一种慢性感染性疾病，是口腔主要疾病之一。由于早期多无明显自觉症状而易被忽视，待有症状时已较严重，甚至导致牙齿不能保留。因而早期的诊断和治疗显得尤为重要。对于牙周炎患者的诊断，一般采用临床牙周病指数(CPDI)、牙周袋内深度和细菌学改变来判定[1]。这些方法往往缺乏客观性数据，而以医师的主观判断为主。

代谢组学是一门“在新陈代谢的动态进程中，系统研究代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质”的学科。近年来被越来越多地应用到生物技术的各个领域，监测和评估一些代谢物的变化以便更全面地分析实验数据[2]。Wong等[3]建立了专业唾液组学数据库(salivaomics knowledge base, SKB)，系统性管理有关唾液研究方面的数据资料。Goldsmith 等[4]认为代谢组学在临床疾病诊断有重要的作用。而且，近年来对于唾液的基础研究备受关注，唾液在疾病早期诊断中具有较明显的优势[5]。

本研究通过收集牙周炎患者和健康个体的唾液，运用代谢组学的方法分析它们的聚类关系，尝试将基于氢谱核磁共振(1H-nuclear magnetic resonance, 1H-NMR)[6]的代谢组学方法应用于早期牙周炎的鉴定。

1　材料和方法

1.1主要试剂和仪器

重水(D2O, 99.8%)(北京百灵威科技有限公司，Cat.261750)，3-三甲基甲硅烷基丙酸-d4钠盐(TSP-d4) (Cambridge Isotope Laboratories Inc., MA, USA)，直径5 mm核磁管(Landisville, NJ, USA)，-80 ℃低温冰箱(Heto Ultra, USA)，DRX600核磁共振仪(Bruker Biospin Rheinstetten, Germany)，分析软件SIMCA-P v11.0(Umea, Sweden)。

1.2试验对象

试验对象从2015年10月—12月华北理工大学附属医院口腔科就诊患者中选择，年龄27～50岁。全部受试者在人工光源下行常规口腔检查，应用口镜和CPI 探针检测全口的牙龈出血指数、牙周袋深度(PD)、附着丧失(AL)和牙齿松动度，全部口腔检查均由同一口腔专业医师进行。按照牙周炎严重程度分组标准[7]：牙龈存在炎症、探诊时出血，PD不超过4 mm，AL 在1～2 mm者判定为轻度牙周炎者。检查结束后，抽取静脉血 2 mL作血常规检查。在符合血常规基本指标在正常水平范围的前提下，选择10名轻度牙周炎作为试验组，男女比例1∶1，同时选取同样条件的10名健康个体(来自华北工理大学在校师生)作为对照。所有参试者均无全身性疾病；妇女未处于怀孕期及哺乳期；半年内未做过牙周基础治疗；未服用过抗生素，患牙无龋坏。均知情同意。

1.3方法

1.3.1唾液采集处理与NMR样本制备

按照Rhodus改良的方法[8]，收集所有参试者非刺激性全唾液，采集时间为上午9:00～11:00，采集前禁食1 h，并用蒸馏水漱口。采集时参试者向4 ℃无菌Eppendorf管内吐出，持续5 min。所得唾液样本于-80 ℃保存。将所有样本在4 ℃，15000 r/min，离心15 min。取上清1 mL加入1/2体积的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液，混匀后静置10 min。4 ℃，15000 r/min，离心10 min，取上清500 μL，加入D2O 250 μL，混匀后取500 μL移入已灭菌的直径为5 mm的NMR管，密封管口，置于-80 ℃低温冰箱保存。测试前取出，解冻并在0 ℃存放。

1.3.2核磁共振图谱的采集和处理

本试验采用600M氢谱核磁共振对样品进行检测，设置参数为：谱宽11261.262 Hz，采样点数32 K，叠加次数64次，饱和频率和中心频率都在水峰位置。所有样本的扫描温度设置为300 K，每个样本核磁扫描均收集到65536个数据点，以D2O为溶剂，经检测得到所测样本的原始自由感应衰减信号(Free Induction Decay, FID)数据。将这些FID信号导入MestReC v4.9.9.6软件进行傅立叶转换(Fourier Transform, FT)，相位校正和基线校正等一系列的操作后获得相位满意、对称性较好的1H-NMR图谱。并将TSP-d4的信号峰值定为0。调用软件中的工具对已处理的图谱进行谱以δ 0.04为单位进行分段积分，积分区域选定在δ 0.0～4.0，每个样品得到100个对应的积分值，所有样本的1H-NMR图谱都进行同样的分段积分后，将所有的积分值导入到Excel文件中保存。

1.4统计学方法

对于试验对象的选取采用两总体方差未知的t检验，评估血常规检测指标是否存在差异；运用SIMCA-P v11.0软件对1H-NMR采集处理的积分数据进行主成分分析(principal components analysis, PCA)和偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)，研究牙周炎患者和健康个体的聚类关系。

2　结　果

2.1试验对象基本指标统计结果

试验组与对照组在白细胞计数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比三个方面无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1研究样本基本指标总体统计结果

Tab 1 The overall statistical results of the basic parameters of the study samples

分组白细胞计数(×109)淋巴细胞 (%)中性粒细胞(%)试验组7.1±1.41)38.9±3.41)56.7±4.51)对照组6.3±1.636.5±2.558.8±5.7

1)与对照组相比，P均>0.05。表中白细胞计数正常水平(4～10)×109，淋巴细胞百分比正常水平20%～40%，中性粒细胞百分比正常水平50%～70%；试验组为牙周炎患者，对照组为健康个体

2.2核磁共振检测结果

将牙周炎患者和健康个体的代谢图谱进行比较可见：牙周炎患者的图谱在δ 3.0～4.0和δ 2.0～2.6区域的波峰与健康个体的图谱比较有较明显不同(图1)，而且图1B在δ 1.0 附近的波峰有明显的升高。

2.3多元统计分析

图2和图3分别是主成分分析得分图和偏最小二乘判别分析得分图，椭圆形区域代表95%的置信区间。图中显示健康个体和牙周炎患者呈现良好的聚类，虽然它们有的较为分散，但是健康个体和牙周炎患者之间并无交叉与重叠，它们之间可以有效区分。而且偏最小二乘判别分析的类聚效果要优于主成分分析。

图1　健康个体和牙周炎患者唾液的1H-NMR图谱Fig 1 The saliva 1H-NMR spectra of healthy individuals and periodontitis patientsA:健康个体；B:牙周炎患者。(1)：δ 3.0～4.0区域；(2)：δ 2.0～2.6区域；(3)：δ 1.0 附近

图2　主成分分析得分图Fig 2 The score plot of principal components analysis

图3　偏最小二乘判别分析得分图Fig 3 The score plot of partial least squares discriminant analysis

3　讨　论

代谢组学是后基因组学时期新兴的一门学科，已经成为系统生物学的一个重要组成部分。和基因组学、蛋白质组学、转录组学这三大“组学”技术相比，代谢组学可以更全面地解释实验数据[9]，进一步完善了系统生物学的技术平台。

本研究在符合白细胞计数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比在正常水平范围的前提下，经统计学分析显示试验组与对照组在白细胞计数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比三个方面无明显差异(P>0.05)，说明所选入试验组与对照组的研究个体在基本生理指标方面做到了组间平衡。收集唾液制取样本经核磁共振检测后，发现牙周炎患者的图谱与健康个体的图谱比较在δ 3.0～4.0和δ 2.0～2.6区域以及δ 1.0 附近的波峰有明显的变化，这些变化均说明牙周炎患者和健康个体的代谢存在着差异。通过主成分分析和偏最小二乘判别分析显示健康个体和牙周炎患者都有良好的聚类效果，这种方法可以很好地区别健康个体和牙周炎患者。在进行数据分析时，为了充分提取数据中的潜在信息，需要应用多元统计分析方法。无监督性的主成分分析(PCA)和监督性的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)是常用的分析方法。主成分分析是用降维的思想，将原来复杂的变量重新组合成一组新的互相无关的综合指标来代替原来的指标，是考察多个变量间相关性的一种多元统计方法。虽然运用PCA有一定的分类效果，但往往有较多重叠，而且在组内聚集和组间离散方面分析效果明显弱于PLS-DA。而偏最小二乘判别分析可以通过釆用响应置换检验判断模型是否稳定可靠，它可以进一步放大组间差异最终对差异性的代谢物进行指认[10]。

代谢组学的相关研究经过这几年的发展，方法日趋成熟，目前，基于核磁共振代谢组学已被应用到很多领域，其在临床疾病诊断的应用也逐渐增多，如心血管系统疾病诊断、肿瘤的早期诊断等[11-13]。而且在口腔癌[14]的早期临床诊断和研究中，代谢组学也显示出了巨大的应用价值。后续研究将针对偏最小二乘判别分析中的VIP图和权系图寻找能够用于鉴别早期牙周炎的差异代谢物。代谢组学正将在未来生物技术领域中将扮演重要的角色，期待这项新的技术在牙周炎早期诊断中成为一个有用的检测工具。

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[2] 王辉，赵志华，徐国权，等．耐药口腔鳞癌Tca8113胞外代谢产物的代谢组学分析[J]．第三军医大学学报，2016，38(4)：396-400．

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[4] Goldsmith P, Fenton H, Morris-Stiff G, et al. Metabonomics: a useful tool for the future surgeon[J]. J Surg Res, 2010, 160(1):122-132.

[5] 程兴群，邓盟，徐欣，等．唾液和唾液组学与疾病早期诊断[J]．国际口腔医学杂志，2014，41(2)：213-219．

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A quick identification of patients with early stage periodontitis using saliva metabolomics

WANG Hui1, KU Li-bo1, XU Guo-quan2, ZHAO Zhi-hua1, MA Li1

(1.DepartmentofStomatology,TangshanVocational&TechnicalCollege,Tangshan063000,China; 2.DepartmentofStomatology,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To study 1H-NMR based metabolomics method in early stage identification of patients with periodontitis. Methods The subjects were divided as the experimental group and the control group by blood routine test, and the differences of basic indicators in the experimental group and control group was analyzed by statistical analysis. The saliva was collected for nuclear magnetic resonance, and the difference between the spectra was preliminarily compared. The clustering relations of all the data was studied by multivariate statistical analysis. Results Statistical analysis showed that leukocyte count, lymphocyte percentage and neutrophil percentage in the experimental group and control group had no significant difference (P>0.05). The obvious changes were observed in the area of δ 3.0～4.0, δ 2.0～2.6 and around δ 1.0 in the spectra of periodontitis patients and healthy individuals. The principal component analysis and partial least-squares discriminant analysis showed that concentrated clustering relations in the internal data of periodontitis patients and healthy individuals. Conclusion 1H-NMR based metabolomics method could distinguish between periodontitis patients and healthy individuals. The metabolomics method is expected to be a new detection method in the early quick diagnosis of periodontitis.

periodontitis; saliva; metabolomics; nuclear magnetic resonance (NMR)

河北省高等学校科学技术研究青年基金项目(QN2015301; QN2016303)

王 辉(1984-)，男，山西大同人，讲师。E-mail:wkate@126.com

��著

10.11724/jdmu.2016.05.06

R781.4

A

1671-7295(2016)05-0440-04

2016-05-26;

2016-09-04)