组氨酸三聚体核苷结合蛋白1在黑素瘤组织中的表达及其基因启动子甲基化水平研究

温斯健 倪娜娜 张韡 宋昊 王小坡 邵雪宝 李阿梅 程伟 孙建方

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所病理科（温斯健、张韡、宋昊、王小坡、邵雪宝、李阿梅、程伟、孙建方），中心实验室（倪娜娜）

组氨酸三聚体核苷结合蛋白1在黑素瘤组织中的表达及其基因启动子甲基化水平研究

温斯健 倪娜娜 张韡 宋昊 王小坡 邵雪宝 李阿梅 程伟 孙建方

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所病理科（温斯健、张韡、宋昊、王小坡、邵雪宝、李阿梅、程伟、孙建方），中心实验室（倪娜娜）

目的检测组氨酸三聚体核苷结合蛋白1（HINT1）在黑素瘤中的表达和HINT1基因启动子甲基化状态，探讨HINT1启动子甲基化与临床病理参数的关系。方法采用甲基化特异性PCR（MSP）法检测56例黑素瘤及瘤旁组织和51例色素痣组织中HINT1基因启动子区甲基化水平，免疫组化法检测56例黑素瘤和51例色素痣组织中HINT1蛋白的表达。结果MSP显示，黑素瘤组织、瘤旁组织及色素痣组织中HINT1基因启动子区甲基化率分别为76.8%（43/56）、33.9%（19/56）和35.3%（18/51），黑素瘤组HINT1基因启动子区甲基化率明显高于瘤旁组织组和色素痣组，且差异有统计学意义（χ2=20.810、18.749，均P＜0.05），瘤旁组织组与色素痣组间差异无统计学意义（χ2=0.022，P＞0.05）。免疫组化显示，56例黑素瘤和51例色素痣组织中分别有12例（21.4%）和42例（82.4%）HINT1蛋白阳性表达，两组阳性率差异有统计学意义（χ2=39.633，P＜0.01）。12例HINT1蛋白阳性的黑素瘤组织中，有6例HINT1基因启动子甲基化，而在44例HINT1蛋白阴性的癌组织中HINT1启动子甲基化率高达84.1%（37/44），两组差异有统计学意义（χ2=6.147，P=0.013）。56例黑素瘤中，HINT1基因启动子区甲基化率在Clark分级Ⅰ～Ⅱ级组（59.1%，13/22）与Ⅲ ～Ⅴ级组（88.2%，30/34）间差异有统计学意义（χ2=6.365，P=0.012）。结论HINT1在黑素瘤组织中低表达，其机制可能与启动子区发生高甲基化有关；HINT1启动子区高甲基化可能参与黑素瘤的发生及发展。

黑色素瘤；甲基化；痣，色素；HINT1基因

组氨酸三聚体核苷结合蛋白1（histidine triad nucleotide⁃binding protein 1，HINT1）又称蛋白激酶C相 互 作 用 蛋 白 1（Protein kinase C⁃interacting protein1，PKCI⁃1），属于组氨酸三聚体蛋白超家族，是一种新近发现的抑癌基因，目前多认为HINT1失活的主要机制是启动子甲基化等［1］。鉴于HINT1蛋白在组织中的表达及其启动子甲基化状态与黑素瘤临床、病理参数的关系尚不清楚，本文应用甲基化特异性PCR（methylation⁃specific PCR，MSP）法检测56例黑素瘤和瘤旁组织及51例色素痣组织中HINT1基因启动子区甲基化水平，应用免疫组化法检测HINT1蛋白水平，分析其与临床病理参数的关系，探讨HINT1启动子甲基化在黑素瘤中的作用。

材料与方法

1.标本来源：所有标本均来自于中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所病理科2013—2014年存档的组织蜡块或4%甲醛浸泡新鲜组织，其中黑素瘤56例，色素痣51例，均经常规HE染色和（或）免疫组化标记后组织病理确诊。

2.主要试剂：兔抗人HINT1抗体（英国abcam公司），DAB酶底物显色试剂盒和即用型快捷免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），TIANquick FFPE DNA Kit石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒（离心柱型）［天根生化科技（北京）有限公司］，高保真热启动酶（日本TaKaRa公司），EZ DNA甲基化试剂盒⁃Gold、人HCT116 DKO甲基化DNA、人 HCT116 DKO非甲基化 DNA（美国ZymoResearch公司）。

3.标本处理：所有4%甲醛固定液中的黑素瘤、瘤旁组织和色素痣标本各取30 mg，用手术刀切为数块，置于1.5 ml离心管中，按照TIANquick FFPE DNA Kit石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒说明书操作，提取基因组DNA，紫外分光光度仪检测其含量和纯度，A260/A280均为1.8～2.0，-20℃保存备用。相应的黑素瘤和色素痣组织蜡块以4 μm厚切片，敷贴于10%多聚赖氨酸预先处理的载玻片上，用于免疫组化实验。

4.免疫组化法：石蜡切片脱蜡至水，柠檬酸高压修复6 min，室温自然冷却，置于10%过氧化氢溶液中，37℃水浴24 h脱色素。然后按试剂盒说明依次加入一抗HINT1单克隆抗体（工作浓度为1∶250）、二抗孵育反应，DAB显色，苏木素复染。观察指标和结果判定：以细胞核和（或）细胞质出现棕黄色颗粒为阳性。已知人结肠组织阳性片作阳性对照，磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。

5.甲基化修饰和MSP扩增：取400 ng提取的DNA入EP管并用无核酶水补至20 μl，加CT转换试剂 130 μl，然后参照 EZ DNA Methylation 试剂盒说明进行亚硫酸氢盐修饰甲基化处理，修饰后的DNA于-20℃保存，1个月内进行检测。在http://genome.ucse.edu网站上查找基因启动子区序列，用CpG Island searcher查找CpG岛，用Methyl Primer Express软件设计引物。甲基化引物：MF：5′⁃GTTGGTCGTATTCGTAGTTTAGGTC ⁃3′，MR：5⁃AATAATCTTCCCAAAAATCGTATCG⁃3′；未甲基化引物：UF：5′⁃GTTGGTTGTATTTGTAGTTTAGGTTGT⁃3′，UR：5′⁃AATAATCTTCCCAAAAATCATATCACC⁃3′，目的片段大小均为240 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。对照组设置：用已知发生完全甲基化的DNA（Human HCT116 DKO methylated DNA）为阳性对照，已知完全非甲基化DNA（Human HCT116 DKO Non⁃methylated DNA）为阴性对照。PCR反应体系：上、下游引物各1 μl，甲基化修饰后的 DNA 4 μl，DNA 热启动酶 0.25 μl，10 × Buffer 2.5 μl，MgCl21.5 μl，dNTP 2 μl，用无核酶水补至25 μl。扩增条件：94℃预变性1 min；94℃变性15 s，57℃退火20 s，72℃延伸20 s，共37个循环；72℃后延伸1 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统观察、记录。仅有甲基化引物扩增出相应片段即为完全甲基化，仅非甲基化引物扩增出相应片段为甲基化阴性，甲基化与非甲基化引物均扩增出相应片段为不完全甲基化，完全甲基化和不完全甲基化均计为甲基化检测阳性。

6.统计学分析：用SPSS 16.0软件进行统计学处理，计数资料组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.HINT1基因启动子区甲基化：56例黑素瘤组织中HINT1启动子区甲基化阳性率为76.8%（43/56），其中20例发生完全甲基化，23例发生不完全甲基化，见图1。56例瘤旁组织中甲基化率为33.9%（19/56），其中8例发生完全甲基化，11例发生不完全甲基化。51例色素痣组织中甲基化率为35.3%（18/51），其中6例发生完全甲基化，12例发生不完全甲基化。黑素瘤组HINT1基因启动子区甲基化率明显高于瘤旁组织组和色素痣组，差异有统计学意义（χ2=20.810、18.749，均P＜ 0.05），而瘤旁组织组与色素痣组间差异无统计学意义（χ2=0.022，P＞ 0.05）。

2.免疫组化HINT1蛋白的表达：56例黑素瘤组织中HINT1阳性12例（21.4%）。12例原位黑素瘤组织中5例HINT1阳性，41例侵袭性黑素瘤组织中7例HINT1阳性，3例转移性黑素瘤组织未见HINT1阳性。51例色素痣中HINT1阳性42例（82.4%）。HINT1在黑素瘤组织中的表达阳性率显著低于色素痣组，差异有统计学意义（χ2=39.633，P＜ 0.01）。见图2。

3.HINT1基因启动子甲基化与其蛋白表达的关系：56例黑素瘤组织中，12例HINT1蛋白阳性组有6例HINT1基因启动子甲基化，而44例HINT1蛋白阴性组HINT1启动子甲基化率高达84.1%（37/44），两组甲基化率差异有统计学意义（χ2=6.147，P=0.013）。

4.HINT1启动子甲基化与临床及病理参数的关系：56例黑素瘤中，Clark分级Ⅰ～Ⅱ级组与Clark分级Ⅲ～Ⅴ级组间HINT1基因启动子区甲基化状态差异有统计学意义（χ2=6.365，P=0.012）。不同性别、有无溃疡、有无炎症细胞浸润组间HINT1基因甲基化状态差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

图1 黑素瘤HINT1启动子区甲基化特异性PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳 M：甲基化引物；U：非甲基化引物；1：标本1（不完全甲基化）；2：标本2（完全甲基化）；3：阳性对照组；4：DNA Marker1；5：DNA Marker2；6：标本3（非甲基化）；7：阴性对照组

表1 黑素瘤HINT1基因甲基化状态与临床及病理参数的关系［例（%）］

讨 论

表观遗传是一种不涉及核苷酸序列变化、可遗传的基因表达调控方式，是较遗传学更为常见的基因表达调控机制，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重构和非编码RNA等［2］。其中启动子区CpG岛异常高甲基化是多种抑癌基因失活的重要机制。黑素瘤中启动子过甲基化多引起细胞黏附、促细胞凋亡、抗细胞增殖和DNA错配修复相关基因的表 达 减 少［3］，如 MGMT［4］、RUNX3［5］、ATG5［6］、RASSF1A［7］等。提示启动子区CpG岛异常高甲基化是黑素瘤发病的一个重要分子机制。

图2 HINT1在黑素瘤和色素痣中的表达 2A：在黑素瘤组织中HINT1仅在真皮浅层肿瘤细胞散在灶状弱阳性表达（免疫组化×200）；2B：在皮内痣中HINT1呈团块状强阳性表达（免疫组化×100）

HINT1蛋白共126个氨基酸，表达于细胞质与细胞核，迄今为止的研究均提示它是一个肿瘤抑制基因。2004年，林彤和孙建方［8］通过cDNA芯片技术发现，HINT1基因表达在黑素瘤患者组织中明显下调。随后，陈柳青等［9］扩大组织样本量并经半定量RT⁃PCR及原位杂交技术进一步证实，HINT1在黑素瘤中的表达显著下调，初步提示该基因可能与人黑素瘤的发生有关。HINT1对肿瘤的生物学行为影响机制尚不十分明确，多数研究认为，HINT1通过抑制基因转录调控通路而发挥肿瘤抑制作用，与CDK7、USF、Pontin/Reptin/β连环素/TCF4复合物、AP1相互作用并抑制其活性，从而发挥抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡、影响信号转导作用［10］。

免疫组化分析显示，HINT1在51例色素痣中阳性率（82.4%）显著高于56例黑素瘤中阳性率（21.4%）。HINT1 mRNA和蛋白表达水平在黑素瘤中均下降，表达趋势一致［9］，提示HINT1表达异常可能与翻译水平之前调控异常有关。进一步采用MSP分析发现，76.8%黑素瘤组织检测到HINT1基因启动子区的异常甲基化，高于相应的瘤旁组织和正常的色素痣组织。而HINT1蛋白阴性的黑素瘤中启动子甲基化率（84.1%）高于HINT1蛋白阳性的黑素瘤组织（50%），HINT1基因甲基化与其蛋白表达可能呈负相关。此结果与Zhang等［1］在原发性肝癌中和Huang等［11］在胃癌细胞株及人胃癌组织中对HINT1的研究结果相似。推测DNA甲基化是一可逆过程，是肿瘤发生过程中的早期事件，可能是因为该基因启动子区高甲基化，导致该基因转录受阻，进一步影响到蛋白的表达，是黑素瘤中HINT1蛋白失活的重要机制。

本研究还发现，HINT1的甲基化与黑素瘤患者的病理Clark分级密切相关。Clark分级Ⅲ～Ⅴ级的黑素瘤组织中HINT1基因启动子区甲基化率（88.2%）显著高于Clark分级Ⅰ～Ⅱ级的黑素瘤组织（59.1%）。Clark分级是黑素瘤预后因素中的重要部分，该结果提示，HINT1基因启动子甲基化可能与黑素瘤进展有关，或可作为黑素瘤预后评估的指标之一。此外，不同性别、有无溃疡、有无炎细胞浸润与HINT1基因甲基化无关。黑素瘤组织HINT1的阳性率21.4%，表达显著下调，阳性病例少，因此未对阳性病例按肿瘤细胞阳性率及染色强度行半定量分析以及相关临床病理分析，下一步可考虑扩大样本后再深入分析。

总之，HINT1在黑素瘤组织中低表达，与其启动子区发生高甲基化有关，HINT1启动子区高甲基化可能参与黑素瘤的发生发展。

［1］ Zhang YJ,Li H,Wu HC,et al.Silencing of Hint1,a novel tumor suppressor gene,by promoter hypermethylation in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Lett,2009,275（2）:277 ⁃284.DOI:10.1016/j.canlet.2008.10.042.

［2］Kubota T,Miyake K,Hirasawa T,et al.Novel etiological and therapeutic strategies for neurodiseases:epigenetic understanding of gene⁃environment interactions［J］.J PharmacolSci,2010,113（1）:3⁃8.

［3］Greenberg ES,Chong KK,Huynh KT,et al.Epigenetic biomarkers in skin cancer［J］.Cancer Lett,2014,342（2）:170 ⁃177.DOI:10.1016/j.canlet.2012.01.020.

［4］Hassel JC,Sucker A,Edler L,et al.MGMT gene promoter methylation correlates with tolerance of temozolomide treatment in melanoma but not with clinical outcome［J］.Br J Cancer,2010,103（6）:820⁃826.DOI:10.1038/sj.bjc.6605796.

［5］Kitago M,Martinez SR,Nakamura T,et al.Regulation of RUNX3 tumor suppressor gene expression in cutaneous melanoma［J］.Clin Cancer Res,2009,15（9）:2988⁃2994.DOI:10.1158/1078⁃0432.CCR⁃08⁃3172.

［6］Liu H,He Z,von Rütte T,et al.Down⁃regulation of autophagy⁃related protein 5（ATG5）contributes to the pathogenesis of early⁃stage cutaneous melanoma［J］.SciTransl Med,2013,5（202）:202ra123.DOI:10.1126/scitranslmed.3005864.

［7］Yi M,Yang J,Chen X,et al.RASSF1A suppresses melanoma development by modulating apoptosis and cell⁃cycle progression［J］.J Cell Physiol,2011,226（9）:2360⁃2369.DOI:10.1002/jcp.22568.

［8］林彤,孙建方.运用cDNA芯片技术对恶性黑素瘤相关基因的研究［J］.中华皮肤科杂志,2004,37（2）:65⁃67.DOI:10.3760/j.issn.0412⁃4030.2004.02.001.Lin T,Sun JF.Study on melanoma gene expression profile by cdnamicroarray［J］.Chin J Dermatol,2004,37（2）:65⁃67.DOI:10.3760/j.issn.0412⁃4030.2004.02.001.

［9］陈柳青,林彤,曾学思,等.组氨酸三聚体核苷结合蛋白1 mRNA在良恶性黑素细胞肿瘤中的表达［J］.中华皮肤科杂志,2006,39（3）:134⁃136.DOI:10.3760/j.issn.0412⁃4030.2006.03.005.Chen LQ,Lin T,Zeng XS,et al.Expression of HINT/PKCI⁃1 mRNA in patients with malignant melanoma and nevus［J］.Chin J Dermatol,2006,39（3）:134⁃136.DOI:10.3760/j.issn.0412⁃4030.2006.03.005.

［10］党永辉,刘仲伟,陈峰,等.三联组氨酸核苷酸结合蛋白1与人类疾病［J］.中国医学科学院学报,2014,36（4）:454⁃460.DOI:10.3881/j.issn.1000⁃503X.2014.04.019.Dang YH,Liu ZW,Chen F,et al.Histidine triad nucleotide⁃binding protein 1 and human diseases［J］.ActaAcad Med Sin,2014,36（4）:454⁃460.DOI:10.3881/j.issn.1000⁃503X.2014.04.019.

［11］Huang H,Wei X,Su X,et al.Clinical significance of expression of Hint1 and potential epigenetic mechanism in gastric cancer［J］.Int J Oncol,2011,38（6）:1557⁃1564.DOI:10.3892/ijo.2011.994.

HINT1 protein expression and gene promoter methylation in melanoma tissue

Wen Sijian,Ni Nana,Zhang Wei,Song Hao,Wang Xiaopo,Shao Xuebao,Li Amei,Cheng Wei,Sun Jianfang
Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Wen SJ,Zhang W,Song H,Wang XP,Shao XB,Li AM,Cheng W,Sun JF）;Central Laboratory,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Ni NN）

ObjectiveTo measure histidine triad nucleotide⁃binding protein 1（HINT1）protein expression and gene promoter methylation,and to analyze the relationship between HINT1 gene promoter methylation and clinical pathological features of melanoma.MethodsFifty⁃six patients with melanoma and 51 patients with nevus were enrolled as subjects and controls,respectively.Methylation⁃specific PCR（MSP）was performed to measure the methylation of HINT1 gene promoter in lesional and paratumoral tissue specimens from the patients with melanoma,as well as in lesional specimens from the patients with nevus.Immunohistochemistry was carried out to quantify the expression of HINT1 protein in these tissue specimens.ResultsMSP showed that the methylation rate of HINT1 gene promoter was significantly higher in melanoma tissues than in paratumoral and nevus tissues（76.8%［43/56］vs.33.9%［19/56］and 35.3%［18/51］,χ2=20.810 and 18.749,respectively,bothP＜ 0.05）,but was insignificantly different between paratumoral and nevus tissues（χ2=0.022,P＞ 0.05）.Immunohistochemistry revealed that the expression rate of HINT1 was 21.4%（12/56）in melanoma tissues,compared to 82.4%（42/51）in nevus tissues（χ2=39.633,P＜0.01）.There was a significant difference in the methylation rate of HINT1 promoter between HINT1⁃positive and ⁃negative melanoma tissues（6/12vs.37/44［84.1%］,P＜ 0.05）,and between Clark levelⅠ-Ⅱ andⅢ-Ⅴ melanoma tissues（59.1%［13/22］vs.88.2%［30/34］,χ2=6.365，P=0.012）.Conclusions HINT1 protein is lowly expressed in melanoma,which may be associated with high methylation of its gene promoter.Moreover,the high methylation of HINT1 gene promoter may be involved in the initiation and progression of melanoma.

Melanoma;Methylation;Nevus,pigmented;Gene,HINT1

s:Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com;Zhang Wei,Email:ifmtjoel@163.com

孙建方，Email：fangmin5758@aliyun.com；张韡，Email：ifmtjoel@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.07.007

国家自然科学基金（81272992）；2012年高等学校博士学科点专项科研基金（20121106110040）；江苏省自然科学基金（BK20131063）；江苏省临床医学科技专项（BL2012003）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81272992）;Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China（20121106110040）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20131063）;Jiangsu Provincial Special Program of Medical Science（BL2012003）

2015⁃11⁃09）

（本文编辑：周良佳 颜艳）