高效液相色谱检测运动饮料中的人工合成色素

周峰

（海南热带海洋学院体育与健康学院，海南三亚572000）

高效液相色谱检测运动饮料中的人工合成色素

周峰

（海南热带海洋学院体育与健康学院，海南三亚572000）

建立一种同时测定运动饮料中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝等6种人工合成色素的固相萃取-高效液相色谱（SPE-HPLC）方法。样品前处理采用固相萃取小柱进行富集和净化，淋洗液选择甲酸-水溶液，洗脱液选择氨化甲醇，氮气吹干后用水复溶上机检测。采用Waters RP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分离，以甲醇-乙酸铵水溶液（20.0 mmol/L）作为流动相，用PDA检测器检测，外标法峰面积定量。结果表明，6种人工合成色素在2.00 μg/mL～32.00 μg/mL浓度范围内线性良好，相关系数r2为0.99，检出限在0.04 μg/mL～0.15 μg/mL，定量限为0.12 μg/mL～0.50 μg/mL，加标回收率达到85.6%～92.4%。该方法具有前处理简单、净化效果好、灵敏度高和检测速度快的优点，适用于运动饮料中人工合成色素的分离和定量检测。

高效液相色谱；运动饮料；人工合成色素

人工合成色素属于化工染色剂，大多以苯、甲苯、萘等化工产品为原料，经过磺化、硝化、偶氮化等一系列有机反应化合而成。由于人工合成色素，生产成本低，给人的感观度好，易溶于水，可直接进行添加等特点，一定程度上弥补了天然色素的一些不足，因此在食品生产加工中被大量应用。但是，大量合成色素的摄入可能引起过敏、哮喘、喉头水肿、鼻炎、荨麻疫、皮肤瘙痒以及神经性头痛等症状，特别是儿童的成长期间，若长期过量摄入合成色素，对生长发育会造成极为不利的影响［1-4］。因此，世界各国对合成色素的使用种类，使用范围和使用量都做了严格限制。在我国标准中，针对运动饮料GB15266-2009《运动饮料卫生标准》规定了允许使用的色素品种、使用范围及最大使用量［5］。

运动饮料是根据人体运动的生理消耗而配置的，针对特殊人群的饮料。运动饮料中主要含有电解质，维生素，氨基酸等成分，能补充人体所需的营养成分，抗疲劳，平衡新陈代谢［6］。但是近些年来运动饮料市场鱼龙混杂，不法商家为了追求饮料的色泽亮丽，超量或者违规添加人工合成色素。由于现行国标中人工合成色素的检验方法GB/T 5009.35-2003《食品中合成着色剂的测定》［7］中的处理方法操作繁琐，加标回收率低等因素，本实验对标准中前处理方法进行了一些相应改变，并进行了加标回收验证。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

高效液相色谱系统：Waters 2695，配PDA检测器：Waters 2998。

柠檬黄（99%）、苋菜红（98%）、胭脂红（92%）、日落黄（97%）、诱惑红（99%）、亮蓝（92%）标准品：均购于国家标准物质中心。

HLB固相萃取小柱：Waters公司，规格3cc。

1.2样品来源

样品均为随机抽取市场上销售的运动型饮料。

1.3色谱条件

色谱柱：Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

柱温：30℃；流动相：乙酸铵（20 mmol/L）水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脱程序为0 min～5.0 min，20% B～35%B；3.0 min～5.0 min，35%B；5.0 min～10.0 min，35%B～98%B；10.0 min～15.0 min，98%B；15.0 min～16.0 min，90%B～15%B。

1.4方法

1.4.1甲醇-乙酸铵水溶液体系中乙酸铵对6种人工合成色素色谱行为的影响

固定流动相梯度洗脱程序，配制不同浓度的乙酸铵水溶液5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mmol/L，考察乙酸铵对6种合成人工合成色素色谱行为的影响。

1.4.2检测波长的选择

本试验采用PDA检测器进行全波长扫描（扫描范围200 nm～600 nm），根据6种人工合成色素的全波长扫描图，选择比较合适的检测波长。

1.4.3标准曲线的制作

称取相应质量的柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝标准品，配制成浓度为2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 μg/mL的标准混合溶液，进行仪器分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.4.4样品前处理条件的优化

运动饮料中除了固有的一些食品基质外，还含有很多的人为添加的营养元素，成分复杂，对前处理要求高，所以本实验样品前处理使用HLB固相萃取小柱，对人工合成色素起到一个净化和富集的作用。并对HLB固相萃取小柱操作条件进行优化，以样品加标平均回收率为比较依据，制定较优的前处理条件。

1.4.5加标回收试验

以市售未检出人工合成色素的运动饮料为空白基质，加入混合标准液，选择优化后的前处理条件操作，氮吹近干后再用水定容，上机检测，计算回收率。

2　结果与讨论

2.1甲醇-乙酸铵水溶液体系中乙酸铵对6种人工合成色素色谱行为的影响

为了了解乙酸铵对6种人工合成色素色谱行为的影响，本研究固定流动相梯度洗脱程序，配制不同浓度的乙酸铵水溶液，乙酸铵浓度分别为5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 mmol/L，考察了乙酸铵对六种合成人工合成色素色谱行为的影响。如图1所示。

结果表明：在甲醇-乙酸铵水溶液体系中，乙酸铵浓度对6种合成人工合成色素的色谱保留行为有不同程度的影响，其浓度与6种合成人工合成色素保留因子的相互关系符合lnk=a+cCB方程［8-10］，且具有良好的线性（r2＞0.99）。当乙酸铵浓度在20.0 mmol/L时，6种合成人工合成色素在RP C18柱上可得到良好的基线分离，其峰型良好。

2.2检测波长的选择

图1　6种合成人工合成色素的色谱图Fig.1The chromatogram of six synthetic colorants

这6种人工合成色素均为水溶性酸性染料，在国标方法中选用254 nm作为这6种人工合成色素的检测波长。但试验发现运动型饮料经前处理后样品的谱图在254 nm波长处的干扰峰比较多，难以满足实际检测需要。所以本试验采用PDA检测器进行全波长扫描（扫描范围210 nm～700 nm），如图2所示。

图2　6种合成人工合成色素的全波长扫描图Fig.2Full wavelength scanning chart of six synthetic colorants

实验结果表明：以上6种人工合成色素除了在紫外区有着较强特征吸收外，由于各种色素的结构中含有不同的发色及助色基团，在可见光区也有最大吸收波长。6种色素最大吸收波长分别为柠檬黄：257.2、427.1 nm；苋菜红215.9、520.7 nm；胭脂红214.7、 509.7 nm；日落黄234.7、484.2 nm；诱惑红212.3、509.7 nm；亮蓝307.2、407.8 nm。综合考虑，选择在500 nm的条件下同时检测检测6种人工合成色素，此时各组分的响应值高，背景干扰小，符合试验的要求。如图3。

图3　运动饮料中苋菜红、胭脂红分别在254 nm波长、500 nm波长下的色谱图Fig.3The chromatograms of amaranth，carmine in sports drink at 254 nm wavelength and 500 nm wavelength

是一款运动型饮料中两种人工合成色素分别在254 nm和500 nm的检测条件下的色谱图对比，可以发现在500 nm的检测条件下，样品的色谱图中杂峰干扰明显小于254 nm检测条件下的谱图。

2.3标准曲线的制作

为了验证6种合成人工合成色素在甲醇-乙酸铵（20 mmol/L）水溶液流动相体系中的线性关系，配制了浓度为2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 μg/mL的系列混合标准溶液。结果见表1。

试验结果表明，6种合成人工合成色素在2.00μg/mL～32.00 μg/mL内均具有良好的线性关系（r2＞0.99）；采用在空白基质中添加目标组分的方法，依据色谱峰的性噪比（S/N）大于3倍确定检出限（LOD），S/N大于10倍确定定量限（LOQ），得到6种目标组分的LOD和LOQ分别为0.04 μg/mL～0.15 μg/mL和0.12 μg/mL～0.50 μg/mL。

表1　6种合成人工合成色素的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table 1Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of six synthetic colorants

2.4淋洗液、洗脱液的选择

参考相关文献［11-12］后，针对于运动饮料的固相萃取流程，样品选择过滤后上样，然后淋洗，最后洗脱。淋洗液是在样品进入吸附剂、目标化合物被吸附后，用较弱的溶剂将弱保留干扰化合物洗掉，一般有用酸化甲醇-水溶液、甲酸-水溶液、柠檬酸-水溶液、水这四种淋洗方式，分别对这4种的淋洗效果进行比较；洗脱液一般是用较强的溶剂将目标化合物洗脱下来，常用的有氨化甲醇、甲醇、酸化甲醇3种洗脱溶剂。

试验结果以6种人工合成色素的平均回收率为比较依据，如图4所示：甲酸-水溶液作为淋洗液效果最好；氨化甲醇的洗脱效果要优于甲醇和酸化甲醇。

图4　淋洗液、洗脱液的选择对6种人工合成色素平均回收率的影响Fig.4The effect of leaching solution and elution solution on the average recovery rate of six synthetic colorants

2.5样品的测定及加标回收

在我们随机抽取的30个批次的运动饮料样品中，根据上述试验结果选择优化后仪器条件，上样后选择甲酸-水溶液淋洗HLB小柱，氨化甲醇洗脱后氮吹，最后用水复容上机检测。结果表明：在所检测的运动饮料样品中，6种合成人工合成色素检出7批次，但均未超过国家限量值。加标回收试验中，在加标浓度为16.00 μg/mL的饮料样品中，6种色素的加标回收率在85.6%～92.4%之间，符合检测要求。

3　结论

建立了一种固相萃取-反相高效液相色谱法梯度洗脱同时检测运动饮料中6种人工合成色素的分析方法。结果表明，在甲醇-乙酸铵体系中，乙酸铵对于溶质的色谱保留行为具有较强的调节能力；在甲醇与乙酸铵的协同作用下，甲醇-乙酸铵（20 mmol/L）水溶液流动相体系中，6种人工人工合成色素得到了良好的基线分离。在500 nm的检测波长下，优化后的HLB固相萃取柱法可有效去除样品中的复杂基质，实现对6种人工人工合成色素的净化与富集，准确有效地检测运动饮料中的人工合成色素。

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［4］Gottlieb A，Shaw C，Smith A，et al.The toxicity of textile reactive azo dyes after hydrolysis and decolourisation［J］.Journal of Biotechnology，2003，101（1）：49-56

［5］中华人民共和国卫生部.GB15266-2009运动饮料卫生标准［S］.北京：中国标准出版社，2009

［6］文剑.运动饮料市场现状及未来发展方向［J］.食品与发酵工业，2007，33（4）：101-106

［7］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.35-2003食品中合成着色剂的测定［S］.北京：中国标准出版社，2003

［8］Dolan J W，Gant J R，Synder L R.Gardient elution in high performance liquid chromatography：II.partical application to reversed phase systems［J］.J Chromatogr，1979，165（1）：31-58

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［10］PC Lu，XM Lu.Development of a high performance liquid chromatography with artifical intelligence［J］.J Chromatogr，1984，292（1）：169-188

［11］刘晓颖，鲁莉，于维森.食品中人工合成着色剂测定方法的改进［J］.卫生研究，2002（12）：479-480

［12］李晓芹，徐振东.固相萃取-高效液相色谱法在食品中合成着色剂检测中的应用［J］.食品工业，2014，35（6）：56-58

Analysis of Synthetic Colorants in Sports Drink by High Performance Liquid Chromatography

ZHOU Feng
（School of Physical Education and Health，Hainan Tropical Ocean University，Sanya 572000，Hainan，China）

A rapid and effective method was established for the determination of six synthetic colorants，including tartrazine，amaranth，carmine，sunset yellow，allura red，and brilliant blue in sports drink by solid－phase extraction coupled with reversed-phase high performance liquid chromatography（SPE-HPLC）.The samples were concentrated and purified by solid phase extraction column，and the leaching solution of formic acid aqueous solution，the eluent of amonium methanol The elution liquid was dried under nitrogen，and detected after re-dissolution with water.The separation of targeted compound was performed on a Waters RP C18chromatographic column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using ammonium acetate aqueous solution（20.0 mmol/L）as mobile phase，with PDA detector and external standard method peak area quantification.The linear range of 6 synthetic colorants was inthe range of 2.00 μg/mL-32.00 μg/mL with a correlation coefficient of 0.99.The detection limit was 0.04 μg/mL-0.15 μg/mL and the quantitative limit was 0.12 μg/mL-0.50 μg/mL.The recovery rate was 85.6%-92.4%.The method has the advantages of simple pretreatment，good purifying effect，high sensitivity and fast detection rate，andis suitable for the separationandquantitative detectionofsynthetic colorants insports drink.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sports drink；synthetic colorants

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.037

周峰（1970—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：运动营养学。

2016-07-04