响应曲面法优化中华鲎卵蛋白多肽制备工艺

戴梓茹，张晨晓，林美芳，李全，利世辉

（钦州学院食品工程学院，广西北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室，广西钦州535011）

响应曲面法优化中华鲎卵蛋白多肽制备工艺

戴梓茹，张晨晓，林美芳，李全，利世辉

（钦州学院食品工程学院，广西北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室，广西钦州535011）

以中华鲎卵蛋白为试验材料，以蛋白质水解度为考核指标，通过单因素试验和响应曲面法优化中华鲎卵蛋白酶解的工艺条件。结果表明，中华鲎卵蛋白的最佳酶解条件为：酶解时间7 h，酶解温度45℃，酶解pH 11.0，加酶量30 000U/g，液料比70∶1（mL/g），在此条件下中华鲎卵蛋白水解度可达32.60%。

中华鲎卵；酶解；多肽；响应曲面

人体不能直接吸收外源蛋白质，必须先将蛋白质消化成小分子的多肽或氨基酸后吸收。而近年研究表明，机体对蛋白质的最佳吸收形式是小分子多肽，同时，多肽还具有抑菌、抗氧化、降血压血脂等多种生理活性功能［1］。因此，将蛋白质水解为小分子多肽，是提高蛋白质资源利用率和功用的重要途径。中华鲎是广泛分布于我国北部湾沿海海域具有“活化石”之称的节肢动物，具有重要的药用和食用价值，民间常有将鲎卵用于治疗眼疾、肝病的偏方［2-4］。研究表明，鲎卵含有16种氨基酸，7种必需氨基酸［5］，是营养丰富的食用蛋白资源。随着鲎养殖技术的日渐成熟，可供食用的鲎将会批量增加，而鲎卵蛋白可以做为优质蛋白资源的重要来源。酶法制备蛋白质多肽具有减少化学试剂污染、缩短水解时间、减少机械设备成本、提高功能多肽含量等优点，是目前食品相关领域的研究热点［6-9］。本研究以中华鲎卵蛋白为试验材料，采用响应曲面法设计试验，以蛋白质水解度为响应值，考察鲎卵蛋白酶解pH值、加酶量和液料比这3个因素对中华鲎卵蛋白质酶解工艺的影响，通过建立回归模型，预测优化酶解工艺条件，并加以验证，最终获得最佳酶解工艺，为中华鲎卵蛋白多肽液的开发利用提供了科学的理论参考。

1　材料和方法

1.1材料与仪器

1.1.1主要材料

中华鲎卵：从钦州三娘湾海域采集成年中华鲎，并通过人工催产得到鲎卵。

1.1.2主要试剂

胰蛋白酶（5 000 U/g）：国药集团化学试剂有限公司；中性蛋白酶（100000U/g）、木瓜蛋白酶（60000U/g）：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；碱性蛋白酶（200 000 U/g）：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.3主要仪器

BCD-539WT冰箱：海尔集团；JT3101N电子天平：上海精天电子仪器设备有限公司；PHS-25PH计：上海圣科仪器设备有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1鲎卵蛋白提取

中华鲎卵真空冷冻干燥→粉碎（过40目筛）脱脂→提取［2.00%NaOH溶液、液料比为40∶1（mL/g）、恒温40℃条件和提取时间110 min］→离心分离（8 000 r/min，10 min）→上层清液加酸至pH值为5.0沉淀→离心分离（8 000 r/min，10 min）→沉淀→乙醇洗涤→真空冷冻干燥→粉碎过筛→鲎卵蛋白粉。

1.2.2酶解工艺

工艺流程：中国鲎卵蛋白粉→恒温振荡酶解→沸水浴灭酶10 min→酶解液→调节至初始pH→pH-Stat法测定蛋白水解度记录消耗的氢氧化钠的体积（mL）。

1.2.3蛋白水解度（DH）的测定［10］

磷酸缓冲溶液调节初始反应体系的pH值，待反应结束后再用0.5 mol/L的氢氧化钠将反应体系的pH值调节至初始pH值，记录反应消耗的氢氧化钠的体积（mL），按下式计算蛋白水解度：

式中：V为消耗氢氧化钠的体积，mL；N为氢氧化钠的浓度，mol/L；α为鲎卵蛋白的平均解离度，α=；m为样品中鲎卵蛋白的质量，g；htot为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，mmol/g。其值取决于底物蛋白的氨基酸组成［5］。本次试验经计算鲎卵蛋白的htot取值为7.5 mmol/g。

1.2.4蛋白酶酶种类的筛选

准确称取0.10 g鲎卵蛋白分别在各蛋白酶最适宜的酶解条件下水解，做平行试验，反应结束用氢氧化钠将反应体系pH值调节至初始pH值，记录消耗的氢氧化钠的量，根据水解度计算公式计算蛋白水解度DH（%）的大小。

1.2.5单因素试验

蛋白质水解受到较多因素的影响，根据预试验结果，选取了影响较大的5个因素进行单因素试验，考察各因素对鲎卵中蛋白质的水解度的影响。

1.2.6酶解工艺优化试验

应用Design-Expert 8.05b软件，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以蛋白水解度为响应值，在单因素试验结果的基础上，综合考虑实际生产需要，选取酶解pH值、加酶量和液料比三因素进行响应面设计和试验，因素水平见表1。

表1　响应曲面试验设计因素水平表Table 1 Factor level table of response surface methodology

2　结果与分析

2.1各种蛋白酶的筛选

同一种底物蛋白被不同蛋白酶水解将会得到不同氨基酸组成和不同分子量的多肽［11］。本试验选用4种常用蛋白酶对中华鲎卵蛋白进行酶解，以筛选出制备多肽的最适蛋白酶，结果见表2。

表2　各种酶设计方案及试验结果Table 2Design of experiment and results

从表2可知，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶对中国鲎卵蛋白水解度的影响最显著的是胰蛋白酶，最大水解度17.90%。其余的均低于15%，这可能与不同蛋白酶的不同酶切位点有关［12］。因此，确定后面的试验选取胰蛋白酶作为水解中国鲎卵蛋白的最佳蛋白酶。

2.2单因素试验结果

2.2.1加酶量对蛋白水解度的影响

根据酶种类筛选试验结果，选择胰蛋白酶酶解中国鲎卵蛋白。准确称取0.10 g鲎卵蛋白，分别添加10 000、20 000、30 000、40 000、50 000 U/g的胰蛋白酶，并将其它条件设定为：pH值为8.0，液料比为50∶1（mL/g），酶解温度为50℃，酶解时间4 h。酶解后测定蛋白水解度（DH），选取水解度最大的加酶量进行后续试验，结果见图1。

结果显示，加酶量从10 000 U/g增加到50 000 U/g，蛋白水解度先上升到峰值后下降。当加酶量大于30 000 U/g时，水解度最大，为15.33%。因此，初步确定最适加酶量为30 000 U/g。

图1　加酶量对蛋白水解度的影响Fig.1Effect of enzyme addition amount on degree of hydrolysis

2.2.2酶解pH值对蛋白水解度的影响

准确称取0.10 g鲎卵蛋白，选择pH值分别为8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，其它水解条件为：液料比50∶1（mL/g），加酶量30 000 U/g，酶解温度50℃，酶解时为4 h，以蛋白水解度（DH）为指标，确定胰蛋白酶酶解中国鲎卵蛋白的最佳酶解pH值，结果见图2。

从图2可知，pH值从8.0升至12.0，鲎卵蛋白的水解度先增大后下降。当pH值为11.0时，水解度最大，为21.60%。因此，确定最适酶解pH值为11.0。

2.2.3液料比对蛋白水解度的影响

准确称取0.10 g鲎卵蛋白，液料比分别为50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1（mL/g），其它水解条件设定为：酶解pH值为11.0，加酶量30 000 U/g，酶解温度50℃，酶解时间4 h，以蛋白水解度（DH）为指标，确定胰蛋白酶酶解中国鲎卵蛋白的最佳液料比，结果见图3。

图3　液料比对蛋白水解度的影响Fig.3Effect of liquid-solid ratio on degree of hydrolysis

液料比从50∶1（mL/g）至90∶1（mL/g），蛋白水解度先升高后下降，峰值为26.00%，此时液料比为70∶ 1（mL/g），因此，选择70∶1（mL/g）为最适液料比。

2.2.4酶解时间对蛋白水解度的影响

准确称取0.10 g鲎卵蛋白，选择酶解时间分别为4、5、6、7、8 h，其它水解条件为：酶解pH值为11.0，液料比70∶1（mL/g），加酶量30 000 U/g，酶解温度50℃，以蛋白水解度（DH）为指标，确定胰蛋白酶酶解中国鲎卵蛋白的最佳酶解时间，结果见图4。

图4　酶解时间对蛋白水解度的影响Fig.4Effect of enzymolysis time on degree of hydrolysis

试验结果显示，随着水解时间从4 h延长到8 h，蛋白水解度从24.8%升高至30.14%后，下降至28.00%。因此，选择蛋白水解度峰值对应的7 h为最适酶解时间。

2.2.5酶解温度对蛋白水解度的影响

准确称取0.10g鲎卵蛋白，选择酶解温度分别为40、45、50、55、60℃，其它水解条件为：加酶量30 000 U/g，pH值为11.0，料液比为70∶1（mL/g），酶解时间为7 h，以蛋白水解度（DH）为指标，确定胰蛋白酶酶解中国鲎卵蛋白的最佳酶解温度，结果见图5。

图5　酶解温度对蛋白水解度的影响Fig.5Effect of enzymolysis temperature on degree of hydrolysis

酶解温度从40℃上升到60℃的酶解过程中，蛋白水解度呈先上升后下降的趋势，当酶解温度为45℃时，蛋白水解度达到峰值，为31.07%。因此，确定最佳酶解温度为45℃。

2.3酶解工艺的优化结果与分析

根据单因素试验结果，以蛋白水解度为考核指标，选择对蛋白水解度影响较大的3个可控工艺参数做为响应面试验的因子，每个因子取3个水平值，设计17组试验（表1），每组做3次平行，取均值。具体设计组合及试验值和软件预测值如表3所示。

表3　酶解条件优化响应面试验设计及结果Table 3Response surface experiment and results of response surface methodology

2.3.1蛋白水解度的方差分析

利用Design Expert软件，通过表3中试验数据进行多元回归拟合，获得中华鲎卵蛋白酶解条件对编码自变量酶解pH值、加酶量和液料比的二次多项回归方程：Y=32.16-2.56A-0.43B+0.48C-1.80AB+1.36AC-0.87BC-2.91A2-8.18B2-3.70C2。方差分析见表4。

表4　回归模型方差分析Table 4Analysis of variances for the regression model

通过回归方程表达各因素与响应值之间的关系，复相关系数R2=0.997 8，这表明中华鲎卵中蛋白水解度的模型拟合程度良好，即这种非线性方程关系是可靠的，因此可以用此模型预测酶解法水解中华鲎卵蛋白的结果，此模型能够描述酶解pH值、加酶量、液料比对鲎卵蛋白水解度的变化规律，能较好优化试验方案。模型的P值小于0.01，表明该模型非常显著，不同条件下蛋白水解度的差异非常显著，方法可行；失拟项P=0.747 5在α=0.05水平上不显著，表明模型与实际情况的拟合可以很好的描述各酶解条件对蛋白水解度的影响。由P值大小可知，在所选各因素水平范围内，对结果的影响大小为：酶解pH（A）＞加酶量（B）＞液料比（C）；一次项A、B和C都非常显著（P＜0.01）；二次项A2B2和C2都非常显著（P＜0.01）；交互项AB、AC和BC都非常显著（P＜0.01）。以上分析表明A、B、C、A2、B2、C2、AB、AC和BC这些因素对蛋白水解度的影响显著。即酶解pH、加酶量、液料比、酶解pH值的平方、加酶量的平方、液料比的平方、交互作用AB、AC和BC效应对中华鲎卵蛋白水解度的影响达到显著水平。

2.4响应曲面优化

建立的回归模型中的任一因素以零为基础，得出其他3个因素的交互影响结果，二次回归方程的响应面及其等高线图见图6～图8。

图6　酶解pH值和加酶量交互影响蛋白水解度的曲面图及等高线图Fig.6Surface plot and contour plot of the combined effects of pH and enzyme addition amount

图7　酶解pH值与液料比交互影响蛋白水解度的曲面图及等高线图Fig.7Surface plot and contour plot of the combined effects of pH and liquid-solid ratio

图8　加酶量与液料比交互影响蛋白水解度的曲面图及等高线图Fig.8Surface plot and contour plot of the combined effects of enzyme addition amount and liquid-solid ratio

图6显示了酶解pH值与加酶量交互作用对蛋白水解度的影响。由图可知，曲面模型体现了随着变量的变化可以得到的最佳值。蛋白水解度随着酶解pH值和加酶量的增加而增加，并达到最大值。酶解pH值与加酶量在取值范围内变化，会对响应值蛋白水解度产生显著的影响。等高线图形椭圆形明显，酶解pH值和加酶量这两个因素的交互作用显著。

图7显示了酶解pH值与液料比交互作用对蛋白水解度的影响。由图可知，在酶解pH值在-1～0，液料比在-1～-0.5的范围内，蛋白水解度不断增加，而之后提高酶解pH值，加大液料比，却使蛋白水解度有下降的趋势。由等高线图形可以判断出，酶解pH值与液料比这两个因素的交互作用影响显著。

图8显示了加酶量与液料比交互作用对蛋白水解度的影响。在试验范围内，两者取值增加，蛋白水解度亦随之增加，达到峰值后，加酶量和液料比取值进一步增大，蛋白水解度下降。由等高线图形可以判断出，加酶量与液料比这两个因素的交互作用显著。

2.5验证试验分析

通过软件分析，得到中华鲎卵中蛋白水解度的最佳工艺条件为酶解pH11.0、加酶量为30 000 U/g、液料比为70∶1（mL/g），该条件下中华鲎卵蛋白水解度预测值为32.16%。采取上述最优条件进行验证试验，平行3次，取平均值，实测得率为32.60%。该值与理论最大值接近，说明采用响应曲面法优化中华鲎卵中蛋白水解度工艺可行。

3　结论

酶法水解蛋白过程中，水解液的量值影响酶分子对蛋白底物的效用，温度影响反应体系的速度和酶的稳定性，酶解体系的组成和反应速率也还会受酶解时间等因素的影响［11-13］。以中华鲎卵蛋白为原料，蛋白水解度为评价指标，采用酶解法对中华鲎卵中蛋白质进行酶解的工艺研究。应用Design-Expert.8.05b软件，以蛋白水解度为响应值，在单因素试验结果的基础上，综合考虑实际生产的需要，对酶解pH值、加酶量和液料比3个因素，采用响应面分析法优化中华鲎卵蛋白水解度工艺，得二次多元回归方程模型：

试验结果表明，最优提取工艺条件为：酶解时间为7 h，酶解温度为45℃，酶解pH值为11.0、加酶量为30 000 U/g、液料比为70∶1（mL/g）。该条件下中华鲎卵蛋白水解度预测值为32.16%。验证试验实测得率为32.60%。该值与理论最大值接近，说明采用响应曲面法优化中华鲎卵中蛋白水解度工艺可行。利用此条件酶解鲎卵中蛋白，可得到较高含量的多肽产品，为鲎卵蛋白酶解液资源的开发提供了基础。

［1］丁利君，黄小梅，何颖基.罗非鱼蛋白制取多肽酶解条件的优化［J］.食品与机械，2008，24（2）：15-18

［2］洪水跟.中国鲎生物学研究［M］.福建：厦门大学出版社，2011：80-81

［3］梁广耀.北部湾鲎资源的初步调查［M］.广西：广西海洋研究所，1994：18-21

［4］代建国，栾崇林，魏京广，等.成熟中国鲎组织中的蛋白质与氨基酸含量分析［J］.食品开科学，2007，28（8）：363-366

［5］代建国，漆林花，魏京广，等.成熟中国鲎卵的营养成分分析［J］.安徽农业科学，2007，35（20）：6142-6143

［6］金文刚，吴海涛，朱蓓薇，等.响应面优化虾夷扇贝生殖腺多肽.Ca2+螯合物制备工艺［J］.食品科学，2013，34（16）：11-16

［7］姜颜.河蟹的品质分析及蟹肉活性肽的研究［D］.辽宁：沈阳农业大学，2014

［8］于阳阳.东北核桃种仁蛋白提取及降血压肽制备研究［D］.黑龙江：东北林业大学，2012

［9］朱芳骞.鲍鱼内脏胶原蛋白多肽的制备及其体外抗氧化活性研究［D］.福建：福建农林大学，2012

［10］袁斌，吕桂善，刘小玲.蛋白水解度的简易测定方法［J］.广西农业生物科技，2002，21（2），113-115

［11］邓洁红，谭兴和，郭时印，等.响应面法优化刺葡萄皮色素提取工艺参数［J］.湖南农业大学学报（自然科学版），2007，33（6）：694-699

［12］易军鹏，朱文学，马海乐，等.响应面法优化微波提取牡丹籽油的工艺研究［J］.2009，30（14）：99-104

［13］李建杰，荣瑞芬.复合酶解制备核桃多肽工艺条件的优化［J］.中国油脂，2011，36（1）：22-26

Optimization Process of Preparation of Polypeptides from Tachypleus Tridentatus Egg by Response Surface Methodology

DAI Zi-ru，ZHANG Chen-xiao，LIN Mei-fang，LI Quan，LI Shi-hui
（College of Food Engineering，Qinzhou University，Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Development and High-value Utilization of Beibu Gulf Seafood Resources，Qinzhou 535011，Guangxi，China）

Using hydrolysis degree of protein as an index，the hydrolysis effects and conditions of tachypleus tridentatus egg protein were optimization by single factor and response surface methodology.The results showed that the optimal hydrolysis conditions were hydrolysis time of 7 h，hydrolysis temperature of 45℃，hydrolysis pH of 11.0，enzyme addition amount of 30 000 U/g，and hydrolysis liquid-solid ratio of 70∶1（mL/g）.Under the optimal hydrolysis conditions，the degree of hydrolysis reached 32.60%.

tachpleus tridentatus eggs；enzymolysis；polypeptides；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.014

广西高校科研项目（LX2014453）

戴梓茹（1982—），女（汉），副教授，博士，从事海洋资源开发与利用研究。

2015-12-08