基于抗氧化活性的豆豉多糖提取工艺优化

吴兰芳，蒋爱民，郑开颜，林敏浩，黄洪媛

（1.河北中医学院药学院，河北石家庄050200；2.华南农业大学食品学院，广东广州510642；3.贵州轻工职业技术学院轻工化工系，贵州贵阳550025）

基于抗氧化活性的豆豉多糖提取工艺优化

吴兰芳1，2，蒋爱民2，郑开颜1，林敏浩2，黄洪媛3，*

（1.河北中医学院药学院，河北石家庄050200；2.华南农业大学食品学院，广东广州510642；3.贵州轻工职业技术学院轻工化工系，贵州贵阳550025）

以DPPH自由基清除能力为评价指标，对米曲霉型豆豉多糖的提取工艺进行优化，并利用苯酚硫酸法对其糖含量进行测定。利用单因素试验和正交试验对米曲霉型豆豉多糖提取工艺进行优化，确定其最优提取条件为：提取温度90℃，提取时间1 h，料液比1∶10（g/mL），乙醇沉淀浓度70%。在此条件下，豆豉多糖的抗氧化能力最强，对DPPH自由基的清除率达64.21%，糖含量为88.93%。

米曲霉型豆豉；多糖；提取工艺；抗氧化

豆豉是我国传统的大豆的发酵制品，以黑褐色或黄褐色、鲜美可口、咸淡适中、回甜化渣、具豆豉特有豉香气者为佳。豆豉含有丰富的蛋白质、脂肪和碳水化合物，还含有多种矿物质和维生素等营养物质［1-2］。豆豉按制曲发酵时所参与的主要微生物种类的不同，豆豉可分为米曲霉型、毛霉型、根霉型、细菌型。本文所采用的原料为阳江豆豉，其为米曲霉型豆豉的典型代表［3］。

多糖又称多聚糖，由存在于自然界的醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，是一切有生命的有机体必不可少的成分［4］。许多研究证明许多天然食品中的多糖是具有清除自由基和代谢调节作用的天然物质［5］。目前对于米曲霉型豆豉的研究集中于菌株的分离与鉴定、发酵工艺的研究、活性成分的提取等方面［6-8］，而对于以抗氧化为指标，优化米曲霉型豆豉多糖的提取工艺鲜见报道，因此本试验拟以米曲霉型豆豉为原料，以DPPH自由基的清除率为评价指标，在单因素试验的基础上，利用正交试验筛选阳江豆豉多糖的最优提取工艺，以期为豆豉作为保健品的开发提供理论基础及科学参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

豆豉：广东阳江市阳帆豆豉厂；硫酸（分析纯）、盐酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、无水乙醇（分析纯）：广州化学试剂厂；维生素C（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；二苯代苦味基肼自由基（DPPH）（分析纯）：百灵威公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

PL203型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；PHS-3精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；UV-1800紫外可见分光光度计：岛津仪器有限公司；冷冻高速离心机5804R：德国艾本德仪器公司。

1.3方法

1.3.1豆豉多糖的提取［9］

豆豉粉碎过60目筛于60℃烘箱烘干，干粉用80%乙醇溶液回流提取2次，减压浓缩回收乙醇后，残渣风干得脱脂豆豉干粉，保存备用。

取经预处理的脱脂豆豉干粉，加入蒸馏水后水浴加热提取。提取后于4 000 r/min离心15 min，收集上清液，残渣按上述方法重复提取2次。合并上清液减压浓缩至一定体积，向浓缩液中加入一定浓度的乙醇，沉淀完全后过滤，真空干燥后得到粗多糖。

1.3.2抗氧化活性评价［10-11］

选取DPPH自由基清除能力为评价指标，对豆豉多糖进行抗氧化活性评价。取0.1 g豆豉多糖，加入10 mL蒸馏水，取3 mL溶液，向样液中加入3 mL 0.16 mmol/L DPPH溶液，于25℃水浴中放置15 min后，在517 nm测得试样吸光度（Ai），取3 mL蒸馏水代替样品测得空白吸光度（A0），向3 mL样品中加入3 mL蒸馏水测得样品本底吸光度（Aj），其中（Ai）每个样品质量浓度做3个平行，取平均值。以维生素C作阳性对照，按下列公式计算清除率。清除率/%=［A0-（Ai-Aj）］/ A0×100。

1.3.3基于抗氧化活性的米曲霉型豆豉多糖的单因素试验［12］

以对DPPH自由基清除率为指标，分别考察多糖沉淀所用的乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比4个因素对米曲霉型豆豉多糖抗氧化能力影响，为正交试验提供有意义的因素及水平。

1.3.3.1乙醇浓度对米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影响

称取10 g豆豉干粉，加入100 mL蒸馏水，在70℃的恒温水浴中提取2 h。弃去滤渣，收集上清液，上清液分别以60%、70%、80%、90%的乙醇沉淀，考察不同浓度乙醇沉淀所得的豆豉多糖对DPPH自由基清除率的影响。

1.3.3.2提取温度对米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影响

称取10 g豆豉干粉，加入100 mL蒸馏水，分别在60、70、80、90、100℃的恒温水浴中提取2 h。过滤，弃去滤渣，收集上清液，上清液用70%乙醇沉淀，沉淀真空干燥。

1.3.3.3提取时间对米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影响

称取10 g豆豉干粉，加入100 mL蒸馏水，在80℃的恒温水浴中分别提取1、2、3、4 h。过滤，弃去滤渣，收集上清液，上清液用70%乙醇沉淀，沉淀真空干燥。

1.3.3.4料液比对米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影响

称取10 g豆豉干粉，分别加入50、100、150、200 mL蒸馏水，在80℃的恒温水浴中提取2 h。过滤，弃去滤渣，收集上清液，上清液用70%乙醇沉淀，沉淀真空干燥，以考察不同料液比对豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影响。

1.3.4正交试验

在单因素试验的基础上，选择提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）为三因素，以DPPH自由基清除率为评价指标，采用L4（93）进行正交试验，因素水平表如表1所示。

表1　豆豉多糖提取正交试验因素水平表Table 1Orthogonal experiment factors and levels of douchi polysaccharide extraction

1.3.5多糖含量的测定方法［13］

采用硫酸-苯酚法测定。

1.3.6数据处理

采用spss16.0、Origin8.0、正交设计助手V3.1等软件对试验结果进行处理分析。

2　结果与分析

2.1豆豉多糖抗氧化性测定的单因素试验

2.1.1乙醇浓度对米曲霉型豆豉多糖DPPH自由基清除率的影响

设定料液比为1∶10（g/mL），提取温度为70℃，反应时间为2 h，考察沉淀多糖所用的乙醇浓度（60%、70%、80%、90%）对豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影响。结果见图1。

图1　乙醇浓度对DPPH自由基清除率的影响Fig.1Effect of alcohol concentration in precipitation on DPPH radical scavenging activity

由图1可见，利用70%的乙醇沉淀得到的多糖对DPPH自由基的清除率最好，且通过方差分析表明，用60%的乙醇沉淀与70%、80%之间存在显著差异，70%和80%的乙醇沉淀不存在显著差异，因此在后续的试验中采用70%的乙醇进行沉淀。

2.1.2提取温度对米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影响

设定料液比为1∶10（g/mL），乙醇浓度为70%，反应时间为2 h，考察提取温度（60、70、80、90、100℃）对豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影响。结果见图2。

图2　提取温度对DPPH自由基清除率的影响Fig.2Effect of extraction temperature on DPPH radical scavenging activity

由图2可见，80℃提取的豆豉多糖对DPPH自由基的清除作用与其它温度提取均存在显著差异，且80℃对DPPH自由基的清除效果最好。因此，在后续试验中选用80℃作为正交设计的中心点。

2.1.3提取时间对豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影响

设定料液比为1∶10（g/mL），酒精浓度为70%，反应温度为80℃，研究提取时间（1、2、3、4 h）对豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影响。结果见图3。

图3　提取时间对DPPH自由基清除率的影响Fig.3Effect of extraction time on DPPH radical scavenging activity

由图3可见，2 h提取的豆豉多糖对DPPH自由基的清除效果最好，经方差分析表明，各组均存在显著差异，因此，在后续实验中选用2 h为正交设计的中心点。2.1.4料液比对豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影响

设定沉淀多糖乙醇浓度70%，反应温度80℃，提取时间2 h，研究料液比对米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影响。结果见图4。

图4　料液比对DPPH自由基清除率的影响Fig.4Effect of ratio of material to water on DPPH radical scavenging activity

由图4可见，料液比为1∶10（g/mL）时，豆豉多糖对DPPH自由基的清除率最高，经方差分析表明，各组之间存在显著差异，因此，在后续试验中选用料液比1∶10（g/mL）作为正交设计的中心点。

2.2豆豉多糖抗氧化性测定正交试验结果

正交试验设计及结果见表2。

极差的大小反应各个因素对指标影响程度的大小，由表2中的极差值R可以看出，3个因素中对米曲霉型豆豉多糖DPPH自由基清除率影响的大小顺序为：提取温度＞料液比＞提取时间。最优的提取条件的水平组合为A3B1C2，即提取温度90℃，提取时间1 h，料液比1∶10（g/mL）。由极差分析得出的最优水平组合并未出现在正交试验组合中，因此进行了验证性试验，结果表明，在最优提取条件下，多糖对DPPH自由基的清除率为64.21%，结果大于正交表中的最大值。因此A3B1C2为本试验的最优组合。

表2　正交试验设计及结果Table 2The design and results of orthogonal experiment

2.3米曲霉型豆豉粗多糖中的糖含量测定结果

标准曲线以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，其回归方程为Y=17.315X+0.021，R2=0.999 1。最优提取工艺所得的粗多糖中糖含量为88.93%（以葡萄糖计）。

3　结论

利用热水浸提法提取米曲霉型豆豉多糖，以抗氧化活性中清除DPPH自由基能力为评价指标，其最佳工艺条件为：提取温度90℃，提取时间1 h，料液比1∶10（g/mL），乙醇沉淀浓度为70%，在此条件下得到的米曲霉型豆豉多糖对DPPH自由基的清除率64.21%，粗多糖中的糖含量为88.93%（以葡萄糖计）。

本文的研究可为米曲霉型豆豉多糖的研究提供一定的理论基础，同时为保健食品的开发提供科学参考，对于拓宽豆豉的应用范围也有一定的帮助。但本文仅以抗氧化活性中的DPPH自由基的清除活力为评价指标，而其它的抗氧化活性指标有待于进一步研究。

［1］蔡曼儿，孙翰，薄芯.中国传统发酵大豆制品的营养［J］.中国酿造，2010（2）：11-16

［2］赵德安.中国豆豉［J］.中国酿造，2003（4）：36-40

［3］庞庆芳，张炳文，孙爱东.中国传统大豆发酵食品——豆豉功能成分的研究进展［J］.食品研究与开发，2006，27（2）：185-187，198

［4］张惟杰.糖复合物生化研究技术（2版）［M］.杭州：浙江大学出版社，1999，11：142

［5］WU Qiong-ying，QU Hong-sen，JIA Jun-qiang，et al.Characterization，antioxidant and antitumor activities of polysaccharides from purple sweet potato［J］.Carbohydrate Polymers，2015，132（18）：31-40

［6］曲直，蒋爱民，孙韵，等.传统阳江豆豉发酵过程中米曲霉的筛选及发酵条件优化［J］.现代食品科技，2013，29（2）：301-305

［7］Zheng Yi，Li Yong，Wang Wei-dong.Optimization of ultrasonic-assisted extraction and in vitro antioxidant activities of polysaccharides from Trametes orientalis［J］.Carbohydrate Polymers，2015，111（13）：315-323

［8］吴兰芳，蒋爱民，曲直，等.霉菌型黑豆豆豉的主要成分及其抗氧化活性研究［J］.现代食品科技，2013，29（1）：51-54

［9］Jing Yong-shuai，Huang Li-jiao，Lv Wenjie，et al.Structure characterization of a novel polysaccharide from pulp tissues of Litchi chinensis and its immnunomodulatory activity［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（4）：902-911

［10］Blois M S.Antioxidant determinations by the use of a stable free radical［J］.Nature，1958，181（26）：1199-1200

［11］Jing Yong-shuai，Cui Xinlu，Chen Zhiyan，et al.Elucidation and biological activities of a new polysaccharide from cultured Cordyceps militaris［J］.Carbohydrate Polymers，2014，102（4）：288-296

［12］马瑞君，郭守军，杨永利，等.正交试验法优选坛紫菜多糖的提取工艺［J］.食品科学，2006，27（12）：524-526

［13］王军，王忠合，章斌，等.麦麸多糖理化特性与抗氧化性分析［J］.食品研究与开发，2015，36（7）：18-22

Optimization of Extraction Process of Polysaccharide from Douchi Based on Antioxidant Activity

WU Lan-fang1，2，JIANG Ai-min2，ZHENG Kai-yan1，LIN Min-hao2，HUANG Hong-yuan3，*
（1.College of Pharmacology，Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，Hebei，China；2.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China；3.Department of Light Industry and Chemical Engineering，Guizhou Light Industry Technical College，Guiyang 550025，Guizhou，China）

DPPH radical scavenging activity as a evaluation index，the extraction process of Aspergillus oryzae douchi polysaccharide was optimized.Using single factor test and orthogonal test to determine the extraction method and the optimum extraction conditions which were that extraction temperature 90℃，extraction time 1 h，ratio of raw material to water 1∶10（g/mL），70%ethanol precipitation.Under this condition，the DPPH radical scavenging activity was 64.21%，and the content of polysaccharide was 88.93%.

Aspergillus oryzae douchi；polysaccharide；extraction process；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.010

河北省教育厅青年基金项目（QN2016187）；河北省大学生创新项目（201514432025）

吴兰芳（1985—），女（汉），讲师，博士研究生，研究方向：药食两用资源开发与利用。

黄洪媛（1986—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：食品营养、微生物。

2015-12-13