尿游离甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素检测标本前处理的尿液酸化研究

王 芳，张 宇，丛祥凤，陈 曦

（中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外医院，临床检验中心北京100037）

·方法研究·

尿游离甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素检测标本前处理的尿液酸化研究

王 芳，张 宇，丛祥凤，陈 曦

（中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外医院，临床检验中心北京100037）

目的 检测24小时尿游离甲氧基肾上腺素（MN）和甲氧基去甲肾上腺素（NMN）是诊断嗜铬细胞瘤的首选筛查方法之一，需寻求24小时尿液收集和游离NMN、MN获得这两个前处理过程中尿液酸化处理的安全可控方式。方法 随机尿标本用于本研究，观察在添加或不添加浓盐酸及在室温或较高温（34℃）存放24小时和在不同酸性条件下（pH值为2、3、4）进行酸水解对尿游离NMN/MN水平的影响。结果 首先发现尿液在室温或较高温条件下不添加盐酸进行酸化存放24小时游离NMN/MN并没有显著降解。之后统计发现不同患者24小时尿量存在较大变化，常规方法留尿过程加入固定剂量的酸会引起pH值的波动（pH值2～4）。通过调节尿液pH值，发现在不同酸性条件进行酸水解尿游离NMN的检测，其水平存在显著差异，pH值大于等于4不能达到酸水解的目的。最后利用40份随机尿标本验证发现尿液不加酸存放24小时但水解时酸化至pH 2为更可控的尿液酸化方式。结论 24小时尿留取过程不必添加盐酸但水解前用盐酸调节pH值到2是尿游离NMN、MN检测更加安全可控的前处理方式。

尿液； 甲氧基肾上腺素； 甲氧基去甲肾上腺素； 盐酸； 嗜铬细胞瘤

嗜铬细胞瘤是一种罕见的来源于嗜铬细胞的神经内分泌肿瘤，儿茶酚胺（catecholamine，CA）及其代谢产物甲氧基肾上腺素（metanephrine，MN）和甲氧基去甲肾上腺素（normetanephrine，NMN）是诊断嗜铬细胞瘤的最重要的生化标志物，尽管有研究表明血浆游离MN和NMN的检测被认为是灵敏度和特异度最高的检测方法［1-2］，但2014年美国内分泌临床指南推荐检测血浆或24小时尿游离MN和NMN作为嗜铬细胞瘤的首选筛查方法［3］。相对于血浆，24小时尿游离MN和NMN检测涉及更多的标本前处理过程，而不恰当或不稳定的前处理则直接影响检测结果的准确性。24小时尿液的收集和游离NMN、MN的获得是最易引入不稳定因素的两个前处理过程。24小时尿液的收集通常需要添加防腐剂或稳定剂，目前对于儿茶酚胺类物质检测最常用的尿液防腐剂是浓盐酸，临床中遇到患者发现防腐剂有刺激性气味、开盖“冒白烟”等情况，因不敢使用而直接弃用，不仅存在极大的安全隐患，也直接影响之后标本的检测。由于NMN、MN相对于CA更为稳定［4］，是否在不添加盐酸的情况下也能保持24小时所收集的尿液的稳定性是本研究拟回答的第一个科学问题。在体液中MN和NMN多数以硫酸盐的形式存在，因此在检测前需要在酸性条件下水解获得游离的MN和NMN。目前24小时尿液收集通常采用固定剂量的盐酸，所收尿液标本因尿量的差异造成pH值的不同，这种酸性条件的差异是否会导致水解程度的差异进而影响被测游离MN和NMN的水平？因此是否能有一种更可控的尿液酸化方式是本研究要回答的第二个科学问题。

材料和方法

1 材料

1.1 实验对象及分组 防腐剂实验采用门诊患者留取的随机尿标本20份，其中常温实验10份，高温实验10份，将每份标本分为2组，第一组添加浓盐酸使其终浓度为1%，室温或高温放置24小时（目前常规剂量），第二组不添加盐酸，室温或高温放置24小时。酸水解实验采用随机尿标本10份，将每份标本分为5组，一组添加浓盐酸使其终浓度为1%，室温放置24小时（常规剂量，pH为3），另设3组室温放置24小时后分别用6N盐酸调pH值为2、3、4（于1mL尿液中分别添加6N盐酸100μL、40μL、20μL），最后一组为前处理过程中完全不加盐酸（pH为7）。整体尿液酸化条件验证实验采用随机尿标本40份，一组添加浓盐酸使其终浓度为1%，室温放置24小时，另一组为室温放置24小时后用6N盐酸调pH值为2。尿量统计通过记录我院2014年1月到12月868例进行尿游离MN和NMN检测患者的24小时尿量进行分析。

1.2 仪器 Waters高效液相色谱仪，具体组成为：515泵、进样器、2465型电化学检测器。

2 测定方法

尿液煮沸30分钟进行水解后进行固相萃取，采用Waters公司MCX固相萃取柱，洗脱液经真空干燥处理后重悬于0.1N盐酸上机检测。液相分析条件：Synergi分析柱（Phenomenex公司）、流动相成分包括乙酸钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、离子对、氯化钠、甲醇、二正丁胺。测定流速为1 mL/min，测定时间为15 min。

3 统计学处理

分析软件采用SPSS 17.0。数据先进行正态性与方差齐性检验，正态分布计量数据以±s表示，采用t检验；非正态分布资料数据以中位数及四分位数间距表示，比较采用Mann-Whitney检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 室温条件下尿液中不添加盐酸不影响尿游离NMN/MN的水平

我们取10份随机尿，模拟临床24小时的尿液收集过程，分为两组，一组添加盐酸放置24小时（盐酸终浓度1%），一组不添加盐酸放置24小时。结果显示24小时放置过程添加和不添加盐酸游离MN、NMN的水平没有显著性差异（表1，NMN，P= 0.3527；MN，P=0.5787），表明MN和NMN在尿液留取过程中较为稳定，24小时尿液收集过程中可以不添加盐酸作为防腐剂。

2 高温条件下尿液不添加盐酸不影响尿游离NMN/MN的水平

考虑夏天气温高对含菌尿液标本的影响，我们另取得10份随机尿，其中3份标本细菌阳性，加盐酸或不加盐酸于34℃放置24小时观察尿游离NMN/MN的水平，结果显示34℃放置24小时后未加酸的含菌标本明显混浊，但添加盐酸组与不添加盐酸组游离MN、NMN的水平没有显著性差异（表2，NMN，P=0.8633；MN，P=0.9314），结果与室温一致。

表2 高温条件下尿液中不添加盐酸不影响尿游离NMN/MN的水平（ng/m L）

3 患者24小时尿量差异影响所收集尿液pH值

为了研究水解过程不同pH值对尿游离NMN、MN的水平的影响，我们首先测量了患者24小时尿量范围，结果显示868例进行尿游离 NMN、MN测定患者的尿量范围是300～5480mL，3000mL以上者占12.3%（图1），说明不同患者24小时尿量存在较大变化，而目前添加防腐剂的方法是不论尿量是多少均添加固定剂量的盐酸（尿量小于1000mL添加10mL，大于1000mL添加15mL），这样造成所收集尿液pH值存在较大差异，其范围为2～4。

4 水解过程不同pH值影响尿游离NMN/MN的水平

既然水解过程的酸化对尿NMN/MN的测定至关重要，我们接下来观察了不同pH值对尿NMN、MN的影响。取10份随机尿，设置常规在收集过程中添加盐酸（盐酸终浓度1%）为对照组，另外三组放置24小时后分别用6N盐酸调pH值为2、3、4，最后一组为前处理过程中完全不加盐酸（pH值为7）。结果显示在不同的pH值条件下，尿游离NMN的水平存在显著差异（P=0.0071）。pH值为2和3组与常规处理组相比没有显著性差异，但pH值为4和7组与常规处理组相比则存在显著性差异，而pH值为2和3组之间以及pH值为4和7组之间则没有显著性差异（表3）。MN的水平在不同的酸水解条件下并没有显著性差异（P=0.7671），但其变化趋势和NMN相似。测得常规处理组（盐酸终浓度1%）的pH值为3，不添加盐酸的尿液pH值为7，表明水解过程若pH值大于等于4则不能达到酸水解的目的，从而影响尿游离NMN或MN的测定。

表3 水解过程不同pH值影响尿游离NMN、MN的水平（ng/mL）

5 尿液收集过程不加盐酸但酸水解过程调节pH到2～3为更可行可控的前处理方式

为了进一步确认应将尿游离NMN、MN测定标本前处理的重点放在水解的酸化条件而非尿液收集过程的酸化，并排除24小时尿液收集过程中滋生的细菌对结果的影响，我们扩大标本量，另取40份随机尿，其中16份尿常规显示细菌阳性（+-+++）。分为三组，一组常规处理，即1%盐酸室温放置24小时（pH值为3），一组室温放置24小时后用盐酸调pH值为2。结果显示NMN和MN在两组之间均无显著性差异，进一步证明尿液收集过程不加盐酸但酸水解过程调节pH到2～3为更可行可控的前处理方式。

表4 尿液酸化的不同策略对尿NMN/MN的影响（ng/mL）

讨 论

24小时尿液收集过程中的酸化防腐以及之后酸水解获得游离NMN、MN是影响24小时尿游离NMN、MN测定结果稳定性的两个重要的标本前处理过程，本研究发现水解过程中有效的酸化，而非尿液收集过程中的酸化，是影响尿游离NMN、MN的关键因素，测定尿游离NMN、MN无需在尿液收集过程中添加盐酸等防腐剂，接收标本后进行酸度调节是保证有效酸水解及检测结果稳定性的更为可控的方式。

24小时尿儿茶酚胺检测通常要在尿液留取过程中添加浓盐酸防腐以及更为重要的防止儿茶酚胺的降解［5］，由此，在尿游离 NMN、MN的检测中人们延用了儿茶酚胺检测的尿液收集方式，但是，研究表明NMN、MN却比它们的生成物去甲肾上腺素和肾上腺素稳定得多，Jacques等［4］的研究指出尿液在室温放置8天NMN和MN的水平并无明显变化，提示尿液NMN、MN的稳定性很好，这与我们的结果相同。而且我们还观察了高温不加酸引起细菌生长的标本对测定结果的影响，发现并不影响NMN、MN的水平，更进一步支持NMN、MN在尿液中的稳定性。浓盐酸作为尿液防腐剂在临床上应用存在较大的安全隐患，尤其对于门诊患者，在自行添加防腐剂的过程中若使用不当一方面可能造成不必要的伤害，另一方面影响结果的准确性，由此，我们推荐尿游离NMN、MN的测定在24小时尿留取过程中可以不添加防腐剂，不过，若是测定尿儿茶酚胺则必须添加酸化剂或稳定剂防止其降解。

也因为在尿游离NMN、MN的检测中延用了儿茶酚胺检测的尿液收集方式，人们忽略了尿液的pH值对之后的水解过程的影响，对于正常尿量的人群添加固定剂量的浓盐酸（10～15mL于24小时尿），pH值通常是3左右，按照本研究结果确实不影响最终NMN、MN的水平，但如果尿量超过正常范围，固定量的盐酸则必然使pH值升高，我们的研究表明pH值≥4时，NMN、MN的浓度明显下降。李明等［6］的研究表明尿液中盐酸浓度必须大于0.5%方能保证儿茶酚胺的稳定，另有文献指出儿茶酚胺保持稳定的pH值是小于3.5［7］，依此推算，若尿量大于3000mL pH值将大于3.5，根据我们的尿量统计分析，这部分人群占12.3%，若直接将标本进行处理必然导致水解程度的不充分，直接影响被测游离MN和NMN的水平。所以既然尿液收集过程不必添加防腐剂，那在水解前用酸调节pH值为最适条件显然为更具操作性且保证结果稳定的前处理方式。

另外，需要说明的是本研究的结果显示不同酸化策略之间在统计学上没有显著性差异，但就两组的中位数而言差异较大，由于 NMN和 MN的参考值范围较大（NMN为0～1464μg/24h；MN为0～394μg/24h），我们就考虑这种差异是否会影响临床的判断？由此我们针对24小时平均尿量依据临床诊断标准对这些标本进行分析，除发现1例在两组均高度怀疑为阳性（正常值上限4倍以上）和1例两组均怀疑为阳性（正常值上限1～4倍）的标本外，其余正常者在两组则均在参考范围内。因此，我们认为在统计学无差异的前提下可以得出不同尿液酸化策略对结果没有显著影响的结论。

综上所述，本研究观察了尿 NMN、MN检测前处理过程不同的尿液酸化策略对测定结果的影响，发现24小时尿液收集不添加浓盐酸但标本接收后用盐酸酸化为pH值为2～3是更加安全可控的前处理方式。

［1］Lenders JW，Pacak K，Walther M M，et al.Biochemical diagnosis of pheochromocytoma：which test is best？JAMA，2002，287（11）：1427-1434.

［2］Hickman P E，Leong M，Chang J，et al.Plasma freemetanephrines aresuperior tourineandplasmacatecholaminesandurine catecholaminemetabolitesfortheinvestigationof phaeochromocytoma.Pathology，2009，41（2）：173-177.

［3］Lenders JW，Duh Q Y，Eisenhofer G，etal.Pheochromocytoma and paraganglioma：an endocrine society clinical practice guideline.J Clin Endocrinol Metab，2014，99（6）：1915-1942.

［4］Jacques J，Willemsen H，Alec Ross，et al.Stability of urinary fractionated metanephrines and catecholamines during collection，shipment，and storage of samples.Clin Chem，2007，53（2）：268-272.

［5］Boomsma F，Alberts G，van Eijk L，et al.Optimal collection and storage conditions for catecholamine measurements in human plasma and urine.Clin Chem，1993，39（12）：2503-2508.

［6］李明，陈适，卢琳，等尿儿茶酚胺标本留取方法的改进性研究.临床和实验医学杂志，2012，11（17）：1358-1359.

［7］Peaston RT，Weinkove C.Measurement of catecholamines and their metabolites.Ann Clin Biochem，2004，41（Pt1）：17-38.

（潘子昂编辑）

Stability of Urinary Fractionated M etanephrine and Normetanephrine during Collection and Storage of Urine Sam ples

WANG Fang，ZHANG Yu，CONG Xiang-feng，CHEN Xi
（Department of Laboratory Medicine，Fuwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing，100037，China）

ObjectiveMeasurementsof24-hfractionatedurinaryfractionatedmetanephrineand normetanephrine are used for the diagnosis of pheochromocytoma，but adequate information is needed regarding collection and storage.M ethods Spot urine samples were collected from 70 volunteers.Aliquots were preserved for 24 hours at room temperature or 34℃ with or without acidification with 12N hydrochloric acid.Sampleswere tested the efficacy of hydrolysis at different acid conditions（pH 2，3 and 4）.Results No clinically relevant degradation was observed for the fractionated metanephrines in unpreserved urine samples after 24 h at room temperature and 34℃.Acidification to pH 4 was not effective for hydrolysis.Compared with acidification during colllection，acidified to pH 2 before acid hydrolysiswas a betterway for detection of fractionated metanephrine and normetanephrine.Conclusion Preservation of urine samples with hydrochloric acid for measurements of urinaryfractionatedmetanephrine andnormetanephrine is not necessary. Acidification to pH 2 before hydrolysis is amore effective and practicalmethod.

Urine； Metanephrine； Normetanephrine； Hydrochloric acid； Pheochromocytoma

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.06.030

2016-03-14；

2016-04-08

王芳（1978—），女，助理研究员，博士，生物化学与分子生物学，主要从事心血管相关疾病生物标志物研究。Tel：010-88398271；E-mail：fray.163@163.com

陈曦，教授，博士，E-mail：chenxifw@126.com