弹性假黄色瘤一例ABCC6基因突变分析

李敏 周乃慧 宋琳毅 杨子良 王淼淼 余秀琴

215006苏州大学附属第一医院皮肤科

弹性假黄色瘤一例ABCC6基因突变分析

李敏 周乃慧 宋琳毅 杨子良 王淼淼 余秀琴

215006苏州大学附属第一医院皮肤科

目的报告1例弹性假黄色瘤，并检测ABCC6基因突变情况。方法分析1例弹性假黄色瘤先证者的临床资料，并收集其父母、儿子及100例无亲缘关系的健康对照的外周血，提取基因组DNA，PCR扩增ABCC6基因编码区31个外显子，并进行DNA直接测序与ABCC6编码蛋白质功能预测。结果先证者父母及儿子表型均正常。基因突变分析显示，先证者存在ABCC6基因c.373G＞A（p.E125K）和c.3703C＞T（p.R1235W）的复合杂合突变，先证者母亲为c.3703C＞T（p.R1235W）杂合突变携带者，先证者父亲和儿子为c.373G＞A（p.E125K）杂合突变携带者，而100例无亲缘关系的健康对照均未检测到该两种突变。物种间序列比对分析发现，ABCC6编码蛋白质第125位谷氨酸和第1235位精氨酸为进化高度保守的序列，SIFT和Polyphen⁃2软件预测c.373G＞A（p.E125K）和c.3703C＞T（p.R1235W）突变为有害变异位点。结论ABCC6基因c.373G＞A（p.E125K）和c.3703C＞T（p.R1235W）的复合杂合突变可能是该例弹性假黄色瘤患者发病的原因。

弹性假黄瘤；DNA突变分析；皮肤表现；杂合子；基因，ABCC6

弹性假黄色瘤（pseudoxanthoma elasticum，PXE）是一种主要累及弹性纤维、并可侵犯人体多种器官和系统的少见遗传性疾病，主要表现为皮肤、眼和心血管系统损害［1⁃2］，发病率1∶50 000 ～ 1∶70 000，女性多于男性［3］。已经证实，PXE的致病基因为ABCC6［4］。现报告1例PXE，并分析其ABCC6基因突变情况。

对象与方法

一、对象

先证者女，47岁，已婚，苏州人。因左眼视力下降9月余，加重2个月于2014年12月至苏州大学附属理想眼科医院就诊。既往近视20年，戴镜矫正。在3岁时家人即发现其颈部、腋下、下腹、腹股沟处肤色及略呈黄色的鹅卵石样丘疹，随年龄增长皮疹稍有增多，无明显自觉症状，未引起重视。否认系统性疾病史，父母体健，非近亲结婚；育有1子，家族中无类似疾病及遗传病史。体检：先证者各系统检查未见异常。皮肤科检查：颈部、腋下、下腹及腹股沟处肤色或略呈黄色的丘疹，沿皮纹分布，外观似鹅卵石样（图1）。颈部皮损组织病理：表皮大致正常，真皮中部见较多断裂、肿胀、呈集簇蓝染的嗜碱性碎片状或颗粒状物（图2）。弹性纤维染色（间苯二酚法）：真皮中部深蓝黑色弹性纤维肿胀、断裂，呈破毛线团状，而正常皮肤组织真皮中部深蓝黑色弹性纤维较长，呈波浪状，走向与表皮平行。钙染色（von Kossa法）：真皮中部可见棕褐色颗粒状和碎片状钙沉积。视力检查：右眼0.05，矫正-2.5DS/-3.0DC*85=0.5+；左眼 0.04，矫正-1.75DS/*85=0.04。眼底检查：双眼视盘周围呈一环形条纹，由此向各个方向放射状发出数条不规则细条纹，右眼细条纹未侵及黄斑，左眼一细条纹侵及黄斑区。眼底荧光造影：双眼眼底血管样条纹，以左眼受累明显，其中左眼血管样条纹侵及黄斑区。实验室检查：血尿常规、生化全套、胸部X线片、心脏彩超、双下肢血管超声及颈部血管超声未见明显异常。

图1 先证者皮损表现 颈部（1A）及腹股沟处（1B）可见肤色或略呈黄色的鹅卵石样排列的丘疹

图2 先证者颈部皮损组织病理 表皮大致正常，真皮中部见较多断裂、肿胀、呈集簇蓝染的嗜碱性碎片状或颗粒状物（2A：HE×100；2B：HE×400）

先证者父母及儿子各系统检查、皮肤科检查、眼底检查、心脏彩超、双下肢血管超声及颈部血管超声均未见异常。

在征得先证者及其家属同意后，采集先证者、先证者父母及儿子外周血各5 ml，并采集100例无亲缘关系的健康人外周血5 ml作为对照。

二、DNA测序

1.DNA提取：用DNA提取试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取基因组DNA。

2.Touch⁃down PCR扩增及DNA测序：通过http：//www.ncbi.nlm.nih.gov检索ABCC6基因mRNA序列，序列对比得到ABCC6基因的全基因组序列，应用DNAMAN软件分别设计覆盖ABCC6基因31个外显子的29对引物（表1）。PCR反应体系（50 μl）：模板DNA 1 μl，上下游引物各1 μl，TaqDNA聚合酶2.5 U，dNTP（10 mmol/L）1 μl，Taq缓冲液5 μl，MgCl2（25 mmol/L）5 μl。反应条件：95 ℃预变性3 min，94℃变性30 s，退火30 s，退火温度63～58℃，前10个循环每个循环降低0.5℃，降至58℃以后每循环维持退火58℃，72℃延伸40～50 s，扩增35个循环，最后72℃修复延伸5～8 min。PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察，纯化回收，ABI3730XL测序仪测序。

3.ABCC6编码蛋白质序列保守性分析及蛋白功能预测：对人、小鼠、大鼠、牛、狗、家兔、大熊猫、猩猩、家猫和鸭嘴兽10种物种的ABCC6编码蛋白质序列进行比对，分析蛋白序列的保守性。应用SIFT和Polyphen⁃2软件预测p.E125K和p.R1235W两个突变点是否为有害突变。

结 果

一、表型分析

根据PXE的诊断标准［5］，先证者诊断为PXE，除皮肤及眼受累外，未见心血管系统及胃肠道受累。先证者父母及儿子表型均正常（图3）。

表1 ABCC6基因外显子PCR扩增引物及产物长度

图3 弹性假黄色瘤家系图

二、DNA直接测序

将DNA直接测序结果与NCBI数据库公布的ABCC6基因序列进行比对，发现先证者ABCC6基因第4号外显子第373位碱基由G突变成A，造成125位氨基酸由谷氨酸变成赖氨酸［c.373G＞A（p.E125K）］；同时第26号外显子第3703位碱基由C变成T，造成1235位氨基酸由精氨酸变成色氨酸［c.3703C＞T（p.R1235W）］。该先证者存在ABCC6基因c.373G ＞ A（p.E125K）和c.3703C ＞ T（p.R1235W）的复合杂合突变，先证者母亲为c.3703C＞T（p.R1235W）杂合突变携带者，先证者父亲和儿子为c.373G＞A（p.E125K）杂合突变携带者（图4），而100例健康对照中均未检测到该两种突变（基因序列版本：GRCh37/hg19）。

三、ABCC6编码蛋白质功能预测

物种间序列比对分析发现，ABCC6编码蛋白质第125位谷氨酸和第1235位精氨酸序列为进化高度保守的序列。SIFT软件对p.E125K突变和p.R1235W突变的功能预测结果为Affect Protein Function，其 score分别为0.01和 0.00。Polyphen⁃2软件的预测结果为可能有害，p.E125K突变和p.R1235W突变的score分别为0.918和1.00。SIFT和 Polyphen⁃2软件预测p.E125K突变和p.R1235W突变均为有害变异位点，可能影响蛋白质功能。

讨 论

PXE是一种少见的常染色体隐性遗传性疾病，主要累及弹性组织，可侵犯人体多个器官和系统，临床上主要表现为皮肤、眼和心血管系统的损害［1⁃3］。PXE尚可合并胃肠道损害，其中以消化道出血最为严重。本研究中，先证者为1例散发病例，结合其皮损表现、皮损组织病理学特点及眼底血管样条纹可明确诊断，但未见明显心血管系统和消化系统损害。

已证实PXE发病与ABCC6基因突变有关［4］。ABCC6基因定位于染色体16p13.1，属于跨膜转运蛋白ATP结合基因家族，包含31个外显子，其mRNA编码由1 503个氨基酸组成的跨膜转运蛋白即多药抗药性相关蛋白（multidrug⁃resistance associated protein 6，MRP6）［6］。ABCC6 编码蛋白质在人肝脏和肾脏中表达最高，皮肤、血管壁和视网膜等组织中仅低水平表达。ABCC6基因突变可引起常染色体隐性遗传性PXE，推测PXE属于代谢性疾病，ABCC6基因编码蛋白质MRP6能够将肝脏的代谢物转运至血循环和外周组织，ABCC6基因突变后，具有正常功能的MRP6蛋白减少甚至缺失，引起与弹性纤维有高亲和力的物质在组织内蓄积，使弹性纤维发生异常钙化、变性、肿胀或断裂等，从而导致PXE患者出现皮肤、眼和心血管等多器官、多系统的损害。但目前ABCC6基因突变后导致PXE发病的确切机制尚不完全明确［7⁃10］。迄今已报道ABCC6致病性突变位点300余个，其中高加索患者以c.3421C ＞ T（p.R1141X）突变和del23⁃29（23⁃29号外显子之间的大片段缺失）突变最为常见，占所有突变的30%以上［11］。而中国PXE患者ABCC6基因突变的研究较少。2008年，杨梅等［12］报道1例散发PXE患者ABCC6基因第28号外显子c.3940C＞T（p.R1314W）突变。2015年，Jin等［13］对22例中国PXE患者ABCC6基因突变分析后发现包括错义突变、插入突变和缺失突变在内的17种致病性突变，但该两项研究均未发现中国PXE患者存在ABCC6基因c.3421C＞T（p.R1141X）突变和del23⁃29突变，提示PXE患者ABCC6基因突变可能存在一定的种族差异。

本研究对1例典型的PXE散发患者的ABCC6基因的31对外显子进行测序，发现先证者存在第4号外显子c.373G＞A（p.E125K）和第26号外显子c.3703C＞T（p.R1235W）的复合杂合突变，分别来自其父母，其儿子仅存在c.373G＞A（p.E125K）杂合突变，其父母及儿子均为单个杂合突变携带者，仍有一个拷贝正常，故未发病，表型均正常；本例先证者符合常染色体隐性遗传模式。查阅文献，患者存在的c.373G＞A（p.E125K）突变和c.3703C＞T（p.R1235W）突变先后分别以纯合和复合杂合的形式在PXE患者中有相关报道［13］，但未检索到PXE患者同时存在c.373G ＞A（p.E125K）和c.3703C ＞T（p.R1235W）复合杂合突变的报道。ABCC6编码蛋白质的第125位谷氨酸为极性带负电荷的氨基酸（酸性氨基酸），p.E125K突变后赖氨酸是极性带正电荷的氨基酸（碱性氨基酸）；第1235位精氨酸为极性带正电荷的氨基酸（碱性氨基酸），p.R1235W突变后色氨酸是非极性氨基酸（疏水氨基酸）。另外，物种间序列比对发现，ABCC6编码蛋白质的第125位谷氨酸和第1235位精氨酸这两个氨基酸位点属于进化高度保守的序列，SIFT和Polyphen⁃2软件预测p.E125K和p.R1235W均为有害变异位点。本文结果提示，c.373G ＞A（p.E125K）和c.3703C ＞T（p.R1235W）的复合杂合突变很可能影响了ABCC6编码蛋白质的结构与功能，从而导致PXE，但具体机制尚不明确，有待进一步的功能学研究证实。这些结果进一步丰富了PXE致病基因ABCC6的突变谱，为今后对PXE患者进行遗传咨询和产前诊断奠定了一定的基础。

志谢中国医学科学院皮肤病医院病理科曾学思教授、苏州大学附属第一医院眼科蔡琴华主任医师、李龙标主任医师、苏州市立医院东区皮肤科冯雨苗副主任医师

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Mutation analysis of the ABCC6 gene in a patient with pseudoxanthoma elasticum

LiMin,Zhou Naihui,Song Linyi,Yang Ziliang,Wang Miaomiao,Yu Xiuqin
Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China Corresponding author:Zhou Naihui,Email:zhounaihui@163.com

ObjectiveTo report a case of pseudoxanthoma elasticum,and to analyze mutations of the ABCC6 gene in the family with pseudoxanthoma elasticum.MethodsClinical data were obtained from a female patient with pseudoxanthoma elasticum and analyzed.Blood samples were collected from the proband,her parents and son,as well as 100 unrelated healthy human controls.Genomic DNA was extracted from these blood samples.PCR was performed to amplify 31 exons of the ABCC6 gene followed by direct DNA sequencing.The function of the protein encoded by the ABCC6 gene was predicted.ResultsThe phenotypes of the patient′s parents and son were all normal.Mutation analysis of the ABCC6 gene revealed compound heterozygous mutations c.373G＞A（p.E125K）and c.3703C＞T（p.R1235W）in the proband,a heterozygous mutation c.3703C ＞ T（p.R1235W）in the proband′s mother,and a heterozygous mutation c.373G ＞ A（p.E125K）in the proband′s father and son.However,neither of the above mutations was found in the 100 unrelated healthy controls.Interspecific sequence alignment showed that glutamic acid at position 125 and arginine at position 1235 of the protein encoded by the ABCC6 gene were highly evolutionarily conserved.As SIFT and Polyphen⁃2 softwares showed,the mutations c.373G ＞ A（p.E125K）and c.3703C ＞ T（p.R1235W）were both predicted to be detrimental variations.ConclusionThe compound heterozygous mutations c.373G＞A（p.E125K）and c.3703C ＞ T（p.R1235W） in the ABCC6 gene may be responsible for the occurrence of pseudoxanthoma elasticum in this patient.

Pseudoxanthoma elasticum;DNA mutational analysis;Skin manifestations;Heterozygote;Genes,ABCC6

周乃慧，Email：zhounaihui@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.12.002

江苏省自然科学基金（BK20140294、BK20130267）

Fund program:Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20140294,BK20130267）

2016⁃05⁃23）

（本文编辑：吴晓初）