沙利度胺对人真皮成纤维细胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

李玉平 张晓光 郭兵申 白艳芝 张丽华 武辰楠 李素月

050000石家庄，河北医科大学第二医院皮肤科（第六作者现在首都儿科研究所附属儿童医院皮肤科）

沙利度胺对人真皮成纤维细胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

李玉平 张晓光 郭兵申 白艳芝 张丽华 武辰楠 李素月

050000石家庄，河北医科大学第二医院皮肤科（第六作者现在首都儿科研究所附属儿童医院皮肤科）

目的研究沙利度胺对健康人真皮成纤维细胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白α1 mRNA和Ⅰ型胶原蛋白α1表达的影响，初步探讨沙利度胺抗真皮纤维化的潜在作用。方法原代培养人正常真皮成纤维细胞，选用第4代成纤维细胞用于后续试验。细胞分为3组，分别用10⁃3、10⁃4、10⁃5mol/L沙利度胺处理，同时设空白对照组（仅用DMEM培养基处理）。24 h后，采用CCK⁃8法检测细胞增殖活性，荧光定量PCR法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白α1 mRNA表达，Western印迹法测定Ⅰ型胶原蛋白α1表达。结果10⁃3、10⁃4mol/L沙利度胺组细胞存活率为77.40%±4.25%、88.56%±6.43%，均显著低于空白对照组（100.00%±6.74%，均P＜0.05），但10⁃5mol/L沙利度胺组（96.66% ± 1.098%）与空白对照组之间差异无统计学意义（P＞ 0.05）。10⁃3、10⁃4、10⁃5mol/L沙利度胺组Ⅰ型胶原蛋白α1 mRNA相对表达水平分别为0.279±0.025、0.427±0.040、0.658±0.032，均显著低于空白对照组（1.016±0.003，均P＜0.05），Ⅰ型胶原蛋白α1表达水平亦显著低于空白对照组（均P＜0.05）。Ⅲ型胶原蛋白α1 mRNA表达水平在10⁃3、10⁃4、10⁃5mol/L沙利度胺组分别为0.551 ± 0.039、0.756 ± 0.025、0.826 ± 0.018，与空白对照组（0.988±0.012）比较显著降低（均P＜0.05）。结论沙利度胺在一定浓度范围内可抑制健康人真皮成纤维细胞增殖，并抑制Ⅰ型胶原蛋白α1 mRNA和蛋白表达及Ⅲ型胶原蛋白α1 mRNA表达。

沙立度胺；成纤维细胞；细胞增殖；胶原Ⅰ型；胶原Ⅲ型

以往研究发现，沙利度胺具有抗血管生成、抗炎、免疫调节等多种生物学作用，在皮肤科中已用于皮肤型红斑狼疮、结节性痒疹等疾病的治疗［1⁃3］。据报道，沙利度胺可通过抑制肺成纤维细胞增殖［4⁃5］、抑制转化生长因子（TGF）⁃β1［6］和胶原蛋白的表达而抑制肝纤维化、肺纤维化等［7⁃8］。而且，沙利度胺能抑制TGF⁃β1刺激后正常真皮及瘢痕疙瘩成纤维细胞纤连蛋白的表达及分泌［5］。病理性瘢痕及皮肤纤维化性疾病主要是由成纤维细胞过度生长和胶原蛋白合成、过度沉积造成，抑制成纤维细胞增殖及胶原合成，是防治该类疾病的关键。我们通过研究沙利度胺在不同浓度下对健康人真皮成纤维细胞增殖活性、Ⅰ型胶原蛋白α1（COLⅠA1）和Ⅲ型胶原蛋白α1（COLⅢA1）mRNA及COLⅠA1表达水平的影响，初步探讨沙利度胺抗真皮纤维化的潜在作用，为术后瘢痕形成的预防及病理性瘢痕的临床治疗和预后评估提供新思路。

材料与方法

一、主要试剂及仪器

沙利度胺（常州制药厂有限公司，原料纯度100%），DMEM培养基（美国Gibco公司），Ⅰ型胶原酶（美国Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青有限公司），荧光定量试剂盒Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits（SYBR Green I）（加拿大 Bio Basic Inc公司），CCK⁃8试剂盒（日本同仁化学试剂公司），兔抗人COLⅠA1单克隆抗体［百奇生物科技（苏州）有限公司］，山羊抗兔二抗（美国CST公司），SP免疫组化染色试剂盒、DAB显色剂（北京中衫生物科技有限公司），DU800型分光光度计（美国Beckman Coulter公司），IX71型倒置显微镜（日本Olympus公司），680型酶标仪（美国Bio⁃Rad公司），化学发光成像系统（上海勤翔科学有限公司）。

二、人真皮成纤维细胞的分离和培养

取健康青年包皮，修剪去除皮下组织，用胰蛋白酶分离真皮和表皮。用0.2%胶原酶在37℃孵箱中消化真皮4～6 h，加PBS平衡盐溶液稀释消化酶，取上清液离心，弃上清液，加入含10%胎牛血清、双抗的高糖DMEM培养基，接种至T⁃25培养瓶中，置37℃、5%CO2孵箱中培养，取4～5代对数生长期细胞进行实验。本研究已通过河北医科大学第二医院医学伦理委员会批准，受试者签署知情同意书。

三、沙利度胺工作液配制以及二甲基亚砜（DMSO）对成纤维细胞增殖的影响

1.工作液配制：用DMSO配制0.2 mol/L的沙利度胺储存液，-20℃保存备用。10 ml离心管中加入950 μl含5%胎牛血清的DMEM，常温放置，取50 μl沙利度胺储存液缓慢注入上述DMEM中，吹打混匀至离心管内无絮状物析出，得到浓度为10⁃3mol/L的沙利度胺工作液，依次稀释10倍得到10⁃4、10⁃5mol/L沙利度胺工作液［5，9⁃11］。避光-20 ℃保存。

2.DMSO对成纤维细胞增殖的影响：本实验中，10⁃3、10⁃4、10⁃5mol/L 沙利度胺工作液里所含 DMSO浓度分别为5 × 10⁃3、5 × 10⁃4、5 × 10⁃5mol/L。将人真皮成纤维细胞分为3组，分别用5 × 10⁃3、5 × 10⁃4、5 ×10⁃5mol/L DMSO处理24 h，同时设空白对照组（不含DMSO），用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖活性，结果示5 × 10⁃3、5 × 10⁃4、5 × 10⁃5mol/L DMSO组与空白对照组细胞增殖活性分别为96.59%±11.37%、99.64% ±9.48%、100.61% ±10.97%、100.00% ±6.74%，各DMSO组与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

四、CCK⁃8法检测沙利度胺对健康人真皮成纤维细胞增殖活性的影响

取成纤维细胞单细胞悬液，每孔200 μl（3×104/ml）接种于96孔板，显微镜下观察，在其生长面积达50% ～ 60%时，弃上清液，分别加入含10⁃3、10⁃4、10⁃5mol/L沙利度胺的培养液培养，并设立空白对照，其内为等量DMEM培养液。每组设5个复孔。培养24 h后加入CCK⁃8 试剂20 μl继续孵育3 h，用酶标仪于560 nm波长处读取吸光度值（A值）。独立重复试验3次。细胞存活率=（实验组A值-调零孔A值）/（空白对照组A值-调零孔A值）×100%。

五、荧光定量PCR法检测COLⅠA1、COLⅢA1 mRNA表达

制备4.5×104/ml的单细胞悬液，定量接种，分组同上，每组设3个重复样本。24 h后，各组细胞内分别加入Trizol试剂1 ml提取各组细胞总RNA，12 g/L凝胶电泳检测其完整性。引物序列应用DNAMAN软件设计，由北京赛百盛生物有限公司合成，COLⅠA1引物：正向 5′⁃TGTGCGATGACGTGAT CTGTA⁃3′，反向5′⁃GTGGTTTCTTGGTCGGTGGGT⁃3′。COLⅢA1 引物：正向 5′⁃AGCCTCCAACTGCTC CTA⁃3′，反向 5′⁃GTCCTCCTACTGCTACTCCA⁃3′。按反转录试剂盒说明书合成cDNA，以此为模板进行聚合酶链反应，置于AB 7300 PCR仪，95℃变性5 min、95℃变性30 s、55℃退火15 s、72℃延伸30 s，40个循环；产物在72℃延伸5 min。在60～95℃进行熔解曲线分析。采用2⁃△△Ct法计算各样品目的基因相对表达水平。

六、Western印迹法检测COLⅠA1表达

制备106/ml的单细胞悬液，定量接种，实验分为空白对照组、10-3mol/L沙利度胺组、10-4mol/L沙利度胺组、10-5mol/L沙利度胺组。作用24 h后，将处理后的细胞吸尽培养基，冷PBS漂洗2次，加入含1 ml蛋白酶+4 μl蛋白酶抑制剂的细胞裂解液冰上裂解15 min，4℃ 15 000×g，离心 20 min，取上清液溶解蛋白质，BCA（bicinchonininc acid）法测定蛋白浓度。加入5×十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液，煮沸变性，总蛋白60 μg上样到12 g/L SDS⁃聚丙烯酰胺浓缩胶凝胶电泳。将蛋白质转印至聚偏二氟乙烯膜，室温封闭1 h，漂洗后将膜分别放入含COLⅠA1（1∶500稀释）及3磷酸甘油醛脱氢酶（GADPH）一抗溶液中4℃孵育过夜，洗膜后再放入羊抗兔二抗溶液室温孵育60 min。化学发光仪中发光成像，并经ImageJ对蛋白条带进行灰度分析，计算COLⅠA1相对表达水平，即目的蛋白与GADPH灰度的比值。

七、数据统计分析

结 果

一、沙利度胺对健康人真皮成纤维细胞增殖活性的影响

10⁃5mol/L沙利度胺组与空白对照组比较，细胞存活率差异无统计学意义（P＞0.05），但10⁃3、10⁃4mol/L组和空白对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

二、沙利度胺对健康人真皮成纤维细胞COLⅠA1、COLⅢA1 mRNA及COLⅠA1蛋白表达的影响

与空白对照组比较，10⁃3、10⁃4、10⁃5mol/L沙利度胺组COLⅠA1、COLⅢA1 mRNA及COLⅠA1蛋白表达水平均显著降低（均P＜0.05）。见图1、表1。

图1 Western印迹法检测人真皮成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白α1链（COLⅠA1）蛋白相对表达水平 1：10⁃3mol/L沙利度胺组；2：10⁃4mol/L沙利度胺组；3：10⁃5mol/L沙利度胺组；4：空白对照组。GAPDH：3磷酸甘油醛脱氢酶

表1 沙利度胺对健康人真皮成纤维细胞增殖活性、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白（COLⅠ、Ⅲ）mRNA（2⁃△△Ct）以及Ⅰ型胶原蛋白（COLⅠ）a相对表达水平的影响（±s）

表1 沙利度胺对健康人真皮成纤维细胞增殖活性、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白（COLⅠ、Ⅲ）mRNA（2⁃△△Ct）以及Ⅰ型胶原蛋白（COLⅠ）a相对表达水平的影响（±s）

注：细胞存活率测定：n=5；mRNA表达及蛋白相对表达量测定：n=3。a：用目的蛋白与3磷酸甘油醛脱氢酶（GADPH）蛋白灰度比值表示；b：与空白对照组比较，P＜0.05

组别空白对照组10⁃3mol/L沙利度胺组10⁃4mol/L沙利度胺组10⁃5mol/L 沙利度胺组F值P值细胞存活率（%）100.00±6.74 77.40±4.25b 88.56±6.43b 96.66±10.98 20.701 0.000 COLⅠA1mRNA 1.016±0.003 0.279±0.025 0.427±0.040b 0.658±0.032b 387.642 0.000 COLⅢA1mRNA 0.988±0.012 0.551±0.039b 0.756±0.025b 0.826±0.018b 148.730 0.000 COLⅠA1蛋白1.773±0.059 0.279±0.020b 0.926±0.048b 1.523±0.027b 72.479 0.000

讨 论

成纤维细胞是皮肤真皮组织中的主要细胞成分，能合成以胶原蛋白为主的细胞外基质，其增殖及合成细胞外基质的特性对于正常真皮结缔组织构成、皮肤创伤修复时肉芽组织形成和真皮纤维化性疾病的发生均具有极其重要的意义。COLⅠA1、COLⅢA1作为真皮组织的主要框架结构，在维持组织的完整性及瘢痕形成过程中发挥重要作用［12⁃13］。我们研究发现，10⁃3、10⁃4mol/L沙利度胺能显著抑制成纤维细胞增殖，而10⁃5mol/L沙利度胺对正常成纤维细胞增殖活性无影响。这与国外研究沙利度胺可在一定浓度范围内抑制肺成纤维细胞增殖［9］及胚胎成纤维细胞［14］的结论相符。而且，上述3种浓度的沙利度胺均可显著抑制健康人真皮成纤维细胞COLⅠA1、COLⅢA1 mRNA的表达，而病理性瘢痕中主要以Ⅰ型胶原增多为主，因此，我们通过Western印迹法对COLⅠA1的表达进行测定，发现沙利度胺可抑制COLⅠA1表达。而沙利度胺在10⁃3mol/L浓度时，对细胞增殖活性的抑制作用可达22%，这也应是该组COLⅠA1基因和蛋白水平降低的原因之一。沙利度胺是否通过影响胶原合成及代谢因子而影响胶原蛋白表达有待进一步研究。

综上所述，沙利度胺在一定浓度范围内对健康人真皮成纤维细胞增殖活性及COLⅠA1、COLⅢA1具有抑制作用，且10⁃5mol/L沙利度胺可在对细胞增殖没有影响的情况下显著抑制COLⅠA1的表达。

［1］Corral LG,Haslett PA,Muller GW,et al.Differential cytokine modulation and T cell activation by two distinct classes of thalidomide analogues that are potent inhibitors of TNF⁃alpha［J］.J Immunol,1999,163（1）:380⁃386.

［2］Privette ED,Werth VP.Update on pathogenesis and treatment of CLE［J］.Curr Opin Rheumatol,2013,25（5）:584 ⁃590.DOI:10.1097/BOR.0b013e32836437ba.

［3］Lan CC,Lin CL,Wu CS,et al.Treatment of idiopathic prurigo nodularis in Taiwanese patients with low⁃dose thalidomide［J］.J Dermatol,2007,34（4）:237 ⁃242.DOI:10.1111/j.1346 ⁃8138.2007.00260.x.

［4］崔森,刘学军.沙利度胺对肺纤维化大鼠肺组织中c⁃jun氨基末端激酶及α⁃平滑肌肌动蛋白表达的影响及意义［J］.中国药物 与 临 床,2013,13（5）:577 ⁃579.DOI:10.11655/zgywylc2013.05.009.Cui S,Liu XJ.Effects and significance of thalidomide on c⁃jun amino acid terminal kinase and α⁃smooth muscle actin expression in rats with pulmonary fibrosis［J］.Chinese Remedies&Clinics,2013,13（5）:577⁃579.DOI:10.11655/zgywylc2013.05.009.

［5］Liang CJ,Yen YH,Hung LY,et al.Thalidomide inhibits fibronectin production in TGF⁃β1⁃treated normal and keloid fibroblasts via inhibition of the p38/Smad3 pathway［J］.Biochem Pharmacol,2013,85（11）:1594 ⁃1602.DOI:10.1016/j.bcp.2013.02.038.

［6］李颖,戴夫,甘慧中,等.沙利度胺对大鼠TNBS结肠炎肠壁纤维化的影响及其机制［J］.临床与病理杂志,2014,34（3）:266⁃271.DOI:10.11714/j.issn.2095⁃6959.2014.03.009.Li Y,Dai F,Gan HZ,et al.Effect of thalidomide on colon fibrosis in rats with chronic colitis induced by 2,4,6⁃trinitrobenzene sulphonic acid［J］.Int J Pathol Clin Med,2014,34（3）:266⁃271.DOI:10.11714/j.issn.2095⁃6959.2014.03.009.

［7］Lv P,Luo HS,Zhou XP,et al.Thalidomide prevents rat liver cirrhosis via inhibition of oxidative stress［J］.Pathol Res Pract,2006,202（11）:777⁃788.DOI:10.1016/j.prp.2006.08.002.

［8］Keifer JA,Guttridge DC,Ashburner BP,et al.Inhibition of NF⁃kappa B activity by thalidomide through suppression of IkappaB kinase activity［J］.J Biol Chem,2001,276（25）:22382 ⁃22387.DOI:10.1074/jbc.M100938200.

［9］Tseng CM,Hsiao YH,Su VY,et al.The suppression effects of thalidomide on human lung fibroblasts:cell proliferation,vascular endothelial growth factor release,and collagen production［J］.Lung,2013,191（4）:361⁃368.DOI:10.1007/s00408⁃013⁃9477⁃1.

［10］Zhang C,Zhang X,Ma L,et al.Thalidomide inhibits adipogenesis of orbital fibroblasts in Graves′ophthalmopathy［J］.Endocrine,2012,41（2）:248⁃255.DOI:10.1007/s12020⁃012⁃9600⁃8.

［11］Moreira AL,Friedlander DR,Shif B,et al.Thalidomide and a thalidomide analogue inhibit endothelial cell proliferationin vitro［J］.J Neurooncol,1999,43（2）:109⁃114.

［12］Egbert M,Ruetze M,Sattler M,et al.The matricellular protein periostin contributes to proper collagen function and is down⁃regulated during skin aging［J］.J Dermatol Sci,2014,73（1）:40⁃48.DOI:10.1016/j.jdermsci.2013.08.010.

［13］Kelly BC,Markle LS,Vickers JL,et al.The imbalanced expression of matrix metalloproteinases in nephrogenic systemic fibrosis［J］.J Am Acad Dermatol,2010,63（3）:483⁃489.DOI:10.1016/j.jaad.2009.09.006.

［14］Miyata M,Tamura E,Motoki K,et al.Thalidomide⁃induced suppression of embryo fibroblast proliferation requires CYP1A1⁃mediated activation［J］.Drug Metab Dispos,2003,31（4）:469⁃475.

Effects of thalidomide on proliferative activity of and expressions of collagenⅠandⅢin human dermal fibroblasts

Li Yuping,Zhang Xiaoguang,Guo Bingshen,Bai Yanzhi,Zhang Lihua,Wu Chennan,Li Suyue
Department of Dermatology,The Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China（the current affiliation of the sixth author was Department of Dermatology,Children′s Hospital Affiliated to Capital Institute of Pediatrics,Beijing 100020,China）
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Li Yuping,Email:lyuping@medmail.com.cn

Li Yuping,Email:lyuping@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate effects of thalidomide on proliferative activity of as well as expressions of collagenⅠα1 and Ⅲα1 mRNAs and collagenⅠα1 protien in human dermal fibroblasts（HDFs）,and to preliminarily explore the potential role of thalidomide in the fight against dermal fibrosis.MethodsHDFs were isolated from the foreskin of a healthy young man,and subjected to primary culture.The fourth⁃passage HDFs were used in the following experiment.Some HDFs were divided into 3 groups to be treated with 10⁃3,10⁃4and 10⁃5mol/L thalidomide respectively,and other HDFs treated with DMEM alone served as the blank control group.After 24⁃hour culture,cell counting kit⁃8（CCK⁃8）assay was performed to evaluate the proliferative activity of HDFs,fluorescence⁃based quantitative PCR to measure the mRNA expressions of collagen Ⅰα1 andⅢα1,and Western⁃blot analysis to determine the protein expression of collagen Ⅰα1.ResultsCompared with the blank control group,the 10⁃3⁃and 10⁃4⁃mol/L thalidomide groups both showed significantly decreased cell survival rates（77.40% ±4.25%and 88.56% ±6.43%vs.100.00% ±6.74%,bothP＜ 0.05）,but the 10⁃5⁃mol/L thalidomide group showed no significant difference（96.66% ± 1.098%,P＞0.05）.Compared with the blank control group,the 10⁃3⁃,10⁃4⁃and 10⁃5⁃mol/L thalidomide groups all showed significantly lower mRNA and protein expressions of collagenⅠα1（mRNA:0.279±0.025,0.427±0.040 and 0.658±0.032vs.1.016±0.003;protein:0.279±0.020,0.926±0.048 and 1.523±0.027vs.1.773±0.059;allP＜0.05）.In addition,the mRNA expressions of collagen Ⅲα1 were also significantly weaker in the 10⁃3⁃,10⁃4⁃and 10⁃5⁃mol/L thalidomide groups compared with the blank control group（0.551±0.039,0.756±0.025 and 0.826±0.018vs.0.988±0.012,allP＜ 0.05）.ConclusionThalidomide within a certain range of concentrations can inhibit the proliferation of HDFs,as well as expressions of collagenⅠα1 mRNA and protein and collagenⅢα1 mRNA.

Thalidomide;Fibroblasts;Cell proliferation;Collagen type I;Collagen typeⅢ

李玉平，Email：lyuping@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.12.006

河北省2013年医学科学研究重点课题计划（2013019）

Fund program:Key Project of Medical Scientific Research Program in Hebei Province in 2013（2013019）

2016⁃04⁃29）

（本文编辑：尚淑贤）