杨翰林,张 达,张 群,薛 光,田万年
(吉林农业科技学院动物科技学院,吉林 吉林 132101)
牛RPLP1基因的克隆和生物信息学分析
杨翰林,张 达,张 群,薛 光,田万年
(吉林农业科技学院动物科技学院,吉林 吉林 132101)
采用RT-PCR法克隆牛RPLP1基因,利用生物信息学分析软件对该基因进行生物信息学分析,应用半定量RT-PCR方法对该基因的组织表达谱进行分析。结果表明,牛RPLP1基因全长为502 bp,包含345 bp的编码区序列,编码114个氨基酸;拓扑预测表明,RPLP1蛋白可能存在3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,2个豆蔻酰化位点,含有一个Ribosomal-P1保守结构域;牛RPLP1基因在多种组织中均表达,在骨骼肌、肝脏和心肌中表达量较高。
克隆;RPLP1基因;牛;生物信息学;半定量RT-PCR
核糖体是蛋白质的翻译场所,研究核糖体对于了解基因表达在翻译水平的调节非常重要[1]。大量研究表明,核糖体蛋白不仅参与核糖体的蛋白质合成,而且还在复制、转录、RNA加工、DNA修复以及细胞增殖、凋亡、发育调控等方面发挥作用[2-4]。核糖体是一个致密的核糖体蛋白颗粒,可离解为2个亚基,2个亚基的形态具有不规则性和不对称性。酸性核糖体磷酸蛋白P1(acidic ribosomal protein,large,P1,RPLP1)是组成核糖体大亚基的蛋白成分之一。研究表明,RPLP1与RPLP0、RPLP2及28S rRNA保守区相互作用,组成了核糖体GTP酶活性中心的主要部分,RPLP1蛋白还可与泛素共价结合形成融合蛋白,参与调节细胞凋亡及转录等重要活动[5-6]。该研究应用RT-PCR方法对延边黄牛的RPLP1基因进行克隆,利用生物学软件对其序列进行分析,同时进行组织表达谱分析,以期为深入研究该基因的表达调控机理奠定基础。
1.1 试验材料 选用吉林省珲春吉星牧业28月龄延边黄牛阉牛。屠宰后采集血液、背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、瘤胃和小肠,采集的样本一部分置于液氮中速冻,-70℃保存,一部分保存于-20℃备用。
1.2 试验方法
1.2.1 总RNA的提取及cDNA合成:采集牛背最长肌样本,用Trizol提取肌肉总RNA。将提取的RNA用紫外分光光度计检测质量,所用RNA的A260/A280均在1.8~2.0。cDNA合成总反应体系为20 μL:总 RNA 2 μg、10×buffer 4 μL、dNTP (2.5 mmol/L)、Oligo(dT15)2 μL、RNase 抑制剂 0.5 μL、M-MLV 反转录酶 1 μL。
1.2.2 引物的设计与PCR扩增:根据已发表的牛RPLP1基因序列设计1对引物,上游引物序列:5′-CTGCCGCTAAGGTGCTCGGTT-3′,下游引物序列:5′-AACAGCTCAGCTTTTTATTCAAT-3′,预期扩增片段大小为502 bp,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应条件如下:94℃预变性5 min,94℃变性 30 s,58℃退火 30 s,72℃延伸 1 min,35个循环,最后72℃延伸5 min。经琼脂糖凝胶电泳检测后,切胶纯化PCR产物,送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。
1.2.3 组织表达谱分析:按照上述方法分别提取延边黄牛背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、瘤胃和小肠组织的总RNA,并反转录成cDNA,以cDNA为模板进行半定量RT-PCR扩增。根据牛RPLP1基因设计引物,上游引物序列:5′-CTTTGCTTCTACTTTCTTCTCCTC-3′,下游引物序列:5′-TGTAAATGTTGAGCCTTTCTGG-3′, 预期扩增片段大小为184 bp,同时根据牛β-actin基因设计引物,上游引物序列:5′-ATTTCTGTCTTGGCCGG TCT-3′,下游引物序列:5′-TCAAGGCAAGTAACCA GAACAC-3′,对PCR循环参数进行优化。
2.1 牛RPLP1基因的克隆和序列分析 以牛背最长肌提取总RNA反转录合成的cDNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物回收纯化后克隆测序。测序结果显示,扩增片段长度为502 bp,与预期扩增片段大小相符。牛RPLP1基因PCR扩增产物电泳结果见图1。
图1 牛RPLP1基因PCR扩增产物电泳结果
2.2 牛RPLP1基因生物信息学分析 ORF Finder软件分析结果表明,该基因的最大开放阅读框(open reading frame,ORF)为 345 bp,编码 114 个氨基酸。经SignalP Server软件分析,该蛋白无信号肽序列,为非分泌性蛋白。采用DNA man软件对其进行预测分析,结果表明该基因编码的蛋白分子质量约为11.51 ku,等电点为3.95,为酸性蛋白。Prosite软件分析结果显示,RPLP1可能存在3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,2个豆蔻酰化位点。利用NCBI的CDD数据库,发现牛RPLP1含有一个Ribosomal-P1保守结构域,结果见图2。
图2 牛RPLP1蛋白保守结构域
2.3 牛RPLP1基因组织表达谱分析 采用半定量RT-PCR分析RPLP1基因在牛不同组织器官中的表达模式。结果显示,RPLP1基因在各个组织中均表达,其中在肌肉、肝脏和心脏中表达量较高(见图 3)。
图3 牛RPLP1基因的组织表达谱
目前,RPLP1基因在人、猪、小鼠和大鼠等物种中被克隆,在其功能研究方面主要认为其与蛋白质合成有关,但其具体功能研究较少。笔者在前期研究中发现,RPLP1表达水平与延边黄牛背最长肌肌内脂肪量存在负相关关系[7],提示该基因可能与牛的肉质性状相关。该研究在此基础上应用RT-PCR方法成功克隆了牛RPLP1基因完整编码区序列,包含345 bp的开放阅读框,其编码114个氨基酸。应用生物学信息学方法对其序列及编码的蛋白质进行分析和预测,结果表明,RPLP1可能存在3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,2个豆蔻酰化位点。利用NCBI的CDD数据库进行分析,发现牛RPLP1含有一个Ribosomal-P1保守结构域。组织表达谱结果显示,RPLP1基因在牛肌肉、心脏和肝脏中表达量较高,提示该基因可能与牛肌肉分化相关。研究结果有利于对牛RPLP1蛋白的功能进行深入研究,对进一步利用该基因改良牛的经济性状具有重要意义。
[1]黄涛.杂种大白×梅山F1代与其母本梅山猪背最长肌间差异表达基因的克隆鉴定及其特征分析[D].武汉:华中农业大学,2006.
[2]CHEN F W,LOANNOU Y A.Ribosomal proteins in cellproliferation and apoptosis[J].Int Rev Immunol,1999,18(5/6):129-448.
[3]NAORA H.Involvementofribosomalproteinsin regulating cell growth and apoptosis:translational modulation or recruitment for extraribosomal activity?[J].Immunol Cell Biol,1999,77(3):197-205.
[4]WOOL I G,CHAN Y L,GLUCK A.Structure and evolution of mammalian ribosomal proteins [J].Biochem Cell Biol,1995,73:933-947.
[5]SHIMIZU T,NAKAGAKI M,NISHI Y,et al.Interaction among silkworm ribosomal proteins P1,P2 and P0 required for functional protein binding to the GTPase-associated domain of 28S rRNA [J].Nucleic Acids Res,2002,30(12):2620-2627.
[6]ARCHIBALD J M,TEH E M,KEELING P J.Novel ubiquitin fusion proteins:ribosomal protein P1 and actin[J].J Mol Biol,2003,328(4):771-778.
[7]田万年,张守发,李香子,等.延边黄牛背最长肌差异表达基因的筛选、 克隆及序列分析 [J].遗传,2011,33(11):1219-1224.
Cloning and Bioinformatics Analysis of the RPLP1 Gene in Cattle
YANG Han-lin,ZHANG Da,ZHANG Qun,XUE Guang,TIAN Wan-nian
(College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural Science and Technology University,Jilin 132101,China)
In the present study,the RPLP1 gene was cloned by RT-PCR assay and was subsequently bioinformatically analyzed with bioinformatics analysis software,and the tissue expression profile of this gene was determined by semi-quantitative RT-PCR method.The results showed that cattle RPLP1 gene was composed of 502 nucleotides,including a single open reading frame of 345 bp which encoded 114 amino acids;topology prediction analysis showed that there were three casein kinaseⅡphosphorylation sites,two N-myristoylation sites and one Ribosomal-P1 conserved domain in RPLP1 protein;semi-quantitative RT-PCR assay showed that RPLP1 gene was widely expressed,and high expression was observed in skeletal,liver and cardiac muscle.
cloning;RPLP1 gene;cattle;bioinformatics;semi-quantitative RT-PCR
S823.812;Q78
A文章顺序编号:1672-5190(2016)10-0008-02
2016-09-25
项目来源:吉林农业科技学院大学生科技创新项目(吉农院合字[2015]第 052 号)。
杨翰林(1996—),男,所学专业为野生动物与自然保护区管理。
田万年(1980—),男,讲师,博士,主要研究方向为动物分子遗传育种。
(责任编辑:赵俊利)