植酸酶技术专利分析

黄 利，赵 翀

（国家知识产权局专利局专利审查协作河南中心，河南 郑州 450002）

植酸酶技术专利分析

黄 利，赵 翀

（国家知识产权局专利局专利审查协作河南中心，河南 郑州 450002）

植酸酶是饲料、食品等工业的重要用酶。目前，尚未有针对植酸酶专利布局的研究报告。从专利申请趋势、国家分布、申请人分布等方面对国内外植酸酶专利申请情况进行分析，并对该领域的专利技术现状进行归纳和总结，以期为我国相关企业和研究机构提供参考。

植酸酶；饲料；专利分析

植酸（肌醇六磷酸）是谷物、豆类、油籽和坚果中磷的主要贮存形式，其含量为1%～5%。植酸具有强大的络合力，通常与钙、镁、锌、钾等矿物质元素结合，形成不溶性盐类。饲料中总磷的1/3是可消化的无机磷，其余的2/3则以有机磷即植酸盐的形式存在。由于植酸盐对于人和猪、禽等单胃动物来说是难以利用的，因为人和单胃动物的肠道内不分泌或只分泌少量的降解植酸的植酸酶，因此，植酸盐的该种特性造成了食品和饲料中的磷及钙、镁、锌、钾等营养元素不能被充分利用。为了保持动物机体的营养均衡，需要额外添加无机磷和矿物质，这不仅造成了饲料加工成本的增加，而且不能利用的植酸盐从粪便中排出，又给环境造成了污染［1-2］。

植酸酶（phytase），又称肌醇六磷酸酶，属于磷酸单脂水解酶，能水解植酸并最终释放出无机磷。1907年，Suzuki等在玉米糠中首次发现植酸酶，之后长期由于植酸酶制剂的成本原因没有在饲料工业中得到应用［3］。近年来，随着生物技术的快速发展，植酸酶的生产成本日益下降，植酸酶饲料添加剂与食品添加剂受到人们的普遍关注，也成为酶制剂研究的一个热点。

笔者利用德温特世界专利索引数据库（DWPI）进行检索，共获得植酸酶相关全球专利申请3548项（一系列同族专利申请视为1项申请，每个专利族中最早的优先权日视为该申请的申请日），应用中国专利检索系统（CPRS）检索得到我国植酸酶相关专利申请1529件 （以上数据均截至2016年6月20日），以此为研究基础，从专利申请趋势、国家分布、申请人分布等方面，分析植酸酶技术的发展状况，以期为从事植酸酶制剂开发和生产的企业和科研机构提供有益参考。

1 全球植酸酶技术专利状况

1.1 专利申请趋势分析 全球植酸酶技术专利申请量的时间分布如图1所示，其中2014、2015年的专利申请尚未全部公开，数据仅供参考。1964年，美 国 公 司 InternationalMinerals&Chemical Corporation首次申请了关于酸性植酸酶制备的专利（US3297548），之后专利申请数量长期维持在每年10件以下的较低水平。直到1996年，植酸酶技术的申请量开始逐渐攀升，从1996年的22项上升到2013年的438项。根据国际专利分类表的分类规则，C12N9/16和C12N15/55分别代表了植酸酶或其基因的专利申请。由此可知，植酸酶技术正处于快速发展阶段，植酸酶制剂也越来越多地被应用到各个相关领域。

图1 全球植酸酶技术专利申请量的时间分布

1.2 专利申请技术来源地区分析 各国有关植酸酶技术专利申请数量的分布见图2。由图2可知，美国和中国的专利申请数量最大，分别占到了40%和44%。美国和中国长期占据着世界饲料生产量前2名的位置，而饲料工业是植酸酶应用最多的领域，因此，这2个国家无论是在植酸酶的开发或是应用方面，都有较多的研究和专利申请量。丹麦和欧洲其他国家也有较多的专利申请，这主要是由于这些地区有几家较大的酶制剂公司，如诺维信、巴斯夫、帝斯曼等。

图2 植酸酶技术来源国家或地区分布

2 我国植酸酶技术专利状况

2.1 专利申请趋势分析 我国植酸酶技术专利申请量的时间分布状况见图3。由于专利申请一般是在申请日18个月后公开，因此，2015、2016年的申请数量仅供参考。由图3可知，1985年中国专利局开始受理专利申请当年即有植酸酶技术相关专利申请，然而在1985—1996年，专利申请量每年仅有1件或者没有；1997年后，专利申请量缓慢增长，这与全球专利申请增长的趋势是一致的，但在2007年之前一直维持在较低水平；从2007年开始，该领域专利申请数量快速增加，从之前的20件左右的水平快速提高到50件以上。但是，快速增长的专利申请主要集中在饲料相关领域，这与我国饲料工业在该阶段的快速发展有关，如2012年我国饲料产量已经超越美国位居世界首位。

图3 我国植酸酶技术专利申请量的时间分布

2.2 专利申请人分布 我国植酸酶技术领域主要专利申请人的分布情况见表1。由表1可以看出，排名前15位的申请人有10家为饲料生产或养殖类企业，其他几家则为国内外有关植酸酶研发的生物技术公司或研究所。如果仅关注植酸酶及酶制剂的开发、生产等技术（不包括应用方面），则可以看出申请量最多的申请人主要以诺维信为代表的国外生物技术公司和以中国农业科学院饲料研究所为代表的国内研究所为主，而青岛蔚蓝生物集团有限公司等国内酶制剂企业也有较多申请。

3 植酸酶研发技术重点领域分析

3.1 研发技术领域分析 植酸酶研究的技术分布情况见表2。由表2可知，植酸酶的研究包括新酶的开发、酶的生产、酶制剂、酶的检测及应用等方面。植酸酶的开发包括新的植酸酶、新的产酶菌株、酶的突变体等方向。植酸酶的应用则主要集中在饲料、肥料和土壤改良剂、食品加工等方面。

3.2 新的植酸酶开发 植酸酶广泛存在于动物、植物、微生物中，其中微生物是植酸酶最重要的来源，筛选能够表达具有特定生物学性质的植酸酶的天然菌株仍是获得新的植酸酶的重要手段。传统的酶或基因的分离方法是基于微生物的分离培养，根据所需特性筛选并克隆得到基因。随着基因工程技术的发展，采用基因突变等手段进行高通量的筛选逐渐成为主流的技术手段。由于饲料生产中的制粒过程需要经过高温加热（一般在75～80℃），进一步筛选耐热性能更好的植酸酶仍是研究的重点［4］。中性植酸酶更加适合于水产养殖，也是目前研究的一个重要方向［5］。此外，酶活性和抗蛋白酶水解性能的提高等也是研究的关注点。

表1 植酸酶技术领域主要专利申请人状况

表2 植酸酶技术领域主要技术分支专利申请状况

CN1051058A是首件有关新的植酸酶的中国专利申请，其公开了从无花果曲霉NRRL 3133克隆植酸酶基因并在黑曲霉中表达的技术。中国农业科学院饲料研究所和中国农业科学院生物技术研究所的专利申请CN1184156A，公开了从黑曲霉菌株A.niger 963克隆得到phyA2基因并对其进行定点突变的技术，利用该技术可使重组酵母中植酸酶的表达量达到50万U/mL发酵液，这也是我国申请人首个有关新的植酸酶的申请。CN101426907A公开了从中间型耶尔森氏菌H-27分离的新型植酸酶，该酶在高温下具有良好的热稳定性、广泛的pH值作用范围以及较强的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性，并且比活为3960 U/mg，是当时已报道的比活最高的植酸酶。CN1688690A公开了对大肠杆菌来源的肌醇六磷酸酶基因APPA进行随机突变，并以枯草芽胞杆菌为宿主进行筛选和表达，得到了具有更高产量的突变体。CN101932703A公开了将枯草芽胞杆菌的中性植酸酶基因phyC的酶蛋白的N、C两端相链接，得到环化的植酸酶，改良的植酸酶具有更好的热稳定性，对外肽酶的降解作用也较野生型有明显的抗性。CN103468660A公开了以野生型淀粉液化芽胞杆菌DSM1061 phyC基因为基础，利用PCR技术对该基因进行点突变，获得了1种突变的中性植酸酶；突变的中性植酸酶与野生酶相比，在40～75℃范围内，活性均有提高，尤其是在50～60℃下活性提高约1倍；在pH值=7.5的条件下，突变酶的活性约为野生酶的3.0倍。

3.3 植酸酶的生产研究

3.3.1 植酸酶的微生物表达：野生型菌株直接发酵产酶量一般较少，如CN101024825A中以黄蓝状菌发酵，得到的植酸酶酶活仅为294 U/mL，因此，采用植酸酶基因工程菌提高酶产量，进行大规模的发酵生产是现今植酸酶生产的主要手段。

作为基因工程菌株的宿主可以是大肠杆菌（CN103740672A）、 毕赤酵母菌（CN101935617A）、枯草芽胞杆菌 （CN1358845A）、曲霉、木霉（CN1268029A）、博伊丁氏假丝酵母菌（CN1224757A）等。通过对启动子等载体元件的选择、密码子的优化、菌株的筛选、发酵工艺的优化，可以实现较高的酶表达量和较低的生产成本。如CN1749399A公开了对AOX1启动子进行改组，得到的毕赤酵母植酸酶表达系统可以利用葡萄糖作为碳源，在简便的发酵条件获得酸性植酸酶的高效表达，从整体上降低生产成本。CN102115735A公开了通过对葡萄糖补料、甲醇诱导等工艺的优化实现了转植酸酶毕赤酵母菌的高密度发酵和植酸酶的高效表达。

转基因菌株直接作为饲料添加剂是植酸酶利用的另一种策略。CN101463360A公开了一种植酸酶的乳酸菌表达体系，利用转基因乳酸菌饲喂动物，可使其长期寄居在动物（主要指猪禽）胃肠道内并分泌植酸酶，起到益生菌和酶制剂的双重作用。CN104988174A公开了将植酸酶基因转入蛹虫草原生质体，再生获得转基因蛹虫草子实体后，以子实体为母种，培养制得转基因蛹虫草菌丝，收集菌体并烘干粉碎制得高表达植酸酶的真菌菌丝饲料添加剂，可直接添加于饲料中饲喂动物。

3.3.2 植酸酶的转基因植物表达：植酸酶的转基因植物表达有2个重要优点：一是，转基因植物可以直接表达足量的植酸酶以替代饲料和食品中额外添加的植酸酶；二是，植物生长过程中根系分泌的植酸酶可以对土壤进行改良。

在国内，中国农业科学院生物技术研究所拥有最多的转植酸酶植物相关专利，早在2002年即提出了有关耐热植酸酶编码基因phyA3的高效植物表达载体pBINPLUSphy的申请（CN1473934A），并且该研究所培养的转植酸酶玉米也已获得我国的转基因植物安全证书。浙江大学也于2008年申请了转大肠杆菌植酸酶基因appA水稻的专利，该专利中使用了外分泌型的转基因载体，得到的转基因水稻能够利用土壤中的有机磷。

3.3.3 植酸酶的转基因动物表达：转基因动物表达的研究有以下3个方向。

①利用家蚕等昆虫反应器进行植酸酶生产。CN1229135A公开了利用家蚕生物反应器生产植酸酶的方法，表达植酸酶的蚕蛹可以直接作为饲料，从蚕蛹中提取的植酸酶可以作为食品添加剂。

②培育组织特异性表达的转基因动物：CN1368843A公开了使用唾液蛋白启动子/增强子序列调控植酸酶等外源基因的表达，得到唾液腺特异表达的转基因动物。CN103695451A公开了唾液腺组织特异性表达β-葡聚糖酶基因—木聚糖酶基因—植酸酶基因融合基因的转基因猪。

③培育可寄生于畜禽体内的寄生生物。CN104673830A公开了能够表达植酸酶的球虫，通过口服的方式将该球虫接种至畜禽体内，使其在肠道内发育的同时表达并释放出植酸酶，进而降解植酸。基于球虫活疫苗在畜禽中的有效应用，该种表达植酸酶的转基因球虫既可以作为疫苗预防畜禽球虫病，而且也能在提高钙磷利用效率的同时降低畜禽粪便中磷元素对环境的污染。

3.4 植酸酶制剂的研究 为了达到特定的使用目的并获得较好的使用效果，一般需要多种酶联合应用，即复合酶。有较多的专利申请涉及各种用途的复合酶，例如CN101285058A公开了一种木薯渣工业用的复合酶制剂，该酶制剂含有复合纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、葡聚糖酶、植酸酶、漆酶等，可以有效降低木薯渣含水量和物料黏度，还可以二次回收废渣中的淀粉，增加淀粉收率。CN102492665A公开了由纤维素酶、果胶酶、多酚氧化酶等组成的普洱茶发酵复合酶制剂，能有效分解茶叶中的纤维素、半纤维素等多糖类及其他物质，从而使细胞内各种理化物质溶出。

酶制剂研究的另一个重点是增加酶的稳定性和利用率。如CN1241634A公开了利用高碘酸钠氧化肌醇六磷酸酶单体并且随后加入己二酸二酰肼交联，加入己二酸二酰肼交联与未交联的肌醇六磷酸酶单体相比，其具有10～15℃的增加的热稳定性。CN101168734A公开了一种包衣微丸植酸酶，该产品在使用、储存时可保持酶活性稳定，抵抗外界高温、高湿等不良环境的能力增强。

3.5 植酸酶的检测研究 植酸酶的检测研究主要集中于两方面。一方面是对于饲料等样品中植酸酶活性、耐温性的检测，如CN102854158A公开了一种快速测定植酸酶耐温性能的方法；CN101493418A公开了饲料中植酸酶的微量测定方法，其首先使用乙酸缓冲液作为透析外液对样品进行透析处理，以降低饲料中无机磷含量，之后进行酶活测定。另一方面的研究是对转植酸酶基因植物或饲料产品的转基因成分检测的研究，如CN101914156A公开了基于植酸酶PHY单克隆抗体的蛋白质芯片的转基因作物检测方法和试剂盒；CN102876800A公开了通过使用扩增植酸酶基因的一对特异引物或者扩增植酸酶基因表达框中构建载体终止子与基因结合区域的一对特异引物进行实时荧光定量PCR的定量检测方法。

3.6 植酸酶的应用研究 饲料工业是植酸酶最重要的应用领域。在植酸酶相关的全部专利申请中，有关饲料的申请达1081件，其中，猪饲料相关专利申请为407件，鸡饲料相关专利申请为312件，鱼虾等水产饲料相关专利申请为85件。植酸酶可以直接加入饲料中使用，如CN1293542A公开了含有植酸酶的动物饲料的制备方法，在饲料成分的团聚前或团聚期间加入热稳定性植酸酶；也可以用于对饲料原料的处理，如CN104904991A公开了使用产朊假丝酵母菌、枯草芽胞杆菌等菌液与植酸酶、纤维素酶等混合后对豆粕原料进行发酵处理以生产蛋白饲料原料的技术。

食品工业也是植酸酶的重要应用领域。植酸酶可用于生产低植酸的食品，增加食品中可利用的矿物质含量，小麦、大米等谷物的处理以及大豆等蛋白原料的处理均可应用。植酸酶也可用于酒类等发酵食品的生产，例如CN105219593A公开了将植酸酶等酶类与酿酒酵母、根霉菌混合作为制酒专用曲酿造清爽型米酒的技术。

植酸酶可以作为肥料和土壤改良剂的成分，施入后可提高土壤的植酸酶活性，促进土壤有机磷转化为无机磷，提高有机磷的生物有效性，与禽畜粪便等有机肥料共同使用能够促进其中的植酸分解释放出无机磷。植酸酶可应用于环保领域，作为除臭剂 （如 CN102107014A）、污水处理剂 （如CN103274484A）的有效成分。植酸酶应用于洗涤剂，可以清除蔬果中残留的有机磷农药 （如CN1760356A）。植酸酶也可用于植酸降解物的生产，如CN85109110A公开了利用含有肌醇六磷酸的原料，在温度为20～70℃、pH值为4～8的条件下制备肌醇三磷酸化合物的技术；CN104561122A公开了利用植酸酶从长角豆中提取肌醇类分子的技术。

4 小结

通过对植酸酶技术相关专利的分析可以看出，植酸酶技术的研究仍然处于快速发展时期。目前，植酸酶技术仍主要集中于国外知名的生物技术公司以及中国农业科学院等高水平科研机构，技术集中度比较高。我国企业虽然专利申请量大，但主要集中于酶的应用，如饲料等产业下游领域，在技术上不占优势。

对植酸酶进行改造，获得具有耐高温、pH值适合范围广等优良特点的酶仍是研发的重点方向。现今，对植酸酶基因进行突变并筛选的技术已经比较成熟，国内企业可以以此为着力点开展相关研究，如青岛蔚蓝生物集团有限公司已有多件专利申请。

此外，对于植酸酶的应用目前仍然集中于饲料领域，而其他领域应用相对较少。因此，有必要开发更加适合其他领域的酶，例如洗涤剂用酶必须要与洗涤剂的主成分如表面活性剂有良好的配伍性，如果能够开发出与表面活性剂有较高相容性的植酸酶将可以提高植酸酶在洗涤剂领域的应用。

［1］郭宝林，高志璞.植酸酶的生产研究进展［J］.饲料工业，2006，27（24）：52-54.

［2］汪世华，吕茂洲，孙长春，等.植酸酶的现状及其研究进展［J］.广州食品工业科技，2002，18（1）：54-57.

［3］李晰亮，李晓薇，赵竟男，等.植酸酶研究进展［J］.黑龙江农业科学，2015（8）：149-153.

［4］邢自力，陈华友，谢芳，等.植酸酶及其热稳定性研究进展［J］.中国生物工程杂志，2003，23（5）：31-35.

［5］姚斌，杨培龙，黄火清，等.中性植酸酶的研究与前景［J］.生物产业技术，2010（4）：42-47.

Patents Analysis on Phytase Technology

HUANG Li，ZHAO Chong
（Patent Examination Cooperation Center of Henan Province，The Patent Office，State Intellectual Property Office，Zhengzhou 450002，China）

Phytase is widely used in feed and food industry.However,there are no research reports on patents distribution of phytase technology.Here,we analyze patents application situation associated with phytase at home and abroad from the aspects of trends in patents application,nation and applicant distribution of phytase patents and we also introduce the current status of phytase patents technology,so as to provide some references for the relevant enterprises and research institutions in China.

phytase；feed；patent analysis

G306；S816.7

A文章顺序编号：1672-5190（2016）08-0058-05

2016-07-10

黄利（1984—），男，助理研究员，硕士，主要从事发明专利实质审查和专利分析工作。

（责任编辑：赵俊利）