MC1R蛋白在不同毛色太行山羊皮肤组织中的表达定位

景炅婕，潘洋洋，张莹姣，马 元，乔利英，刘建华

（山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801）

MC1R蛋白在不同毛色太行山羊皮肤组织中的表达定位

景炅婕，潘洋洋，张莹姣，马 元，乔利英，刘建华

（山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801）

MC1R基因是调节哺乳动物毛色形成的重要候选基因之一，编码黑色素皮质素受体1（MC1R），在哺乳动物黑色素的代谢中发挥重要作用。分别选取纯黑色、纯白色、黄褐色和黑斑白色的太行山羊皮肤组织，通过HE染色技术，观察太行山羊的皮肤组织结构；利用免疫组化技术，对MC1R蛋白在4种毛色太行山羊皮肤组织中的表达情况进行研究。结果表明，太行山羊皮肤由表皮、真皮、皮下结缔组织3部分组成；MC1R蛋白在4种毛色太行山羊的表皮、真皮中均没有表达，但在纯黑、黄褐和黑斑白色太行山羊毛囊中有表达，且主要集中在毛囊外根鞘处。研究结果为太行山羊进一步的提纯选育工作提供了一定的依据。

太行山羊；皮肤组织；MC1R；HE染色；免疫组织化学技术

哺乳动物毛皮的颜色主要是由黑色素细胞中黑色素颗粒的数量、性质和分布决定的［1］。黑色素是一种不溶于水和几乎所有溶剂的无定型小颗粒。在动物体内，黑色素分为2类：真黑素和伪黑素。真黑素表现黑色和褐色2种毛色类型，而伪黑素表现黄色和红色的毛色［2］。黑色素的合成是一个复杂的调控过程，受多个基因的共同调控。

MC1R基因是黑色素合成过程中重要的候选基因之一，只有1个外显子，在哺乳动物中由扩散位点（extension locus，E）编码［3］。MC1R 编码黑素皮质素受体 1（melanocortin 1 receptor，MC1R），也叫促黑素细胞素受体 （melanocyte stimulating hormonereceptor，MSHR），该受体在不同物种中均有7个跨膜结构域，一般约含有310个氨基酸［4］，其N末端位于细胞外，C末端位于细胞内［5］，跨膜的肽链是α螺旋结构，受体的胞外区与配体结合，胞内区与G蛋白相连。

MC1R属于G蛋白偶联表面受体，是G蛋白偶联受体家族中最小的一个，黑素细胞刺激素α（α melanocyte stimulating hormone，α-MSH）是多肽类激素，当MSH与MC1R结合后，活化的G蛋白会激活膜上的腺苷酸环化酶系统，在Mg2+存在的情况下，催化三磷酸腺苷 （ATP）转化为环腺苷酸（cAMP），cAMP水平升高时，会进一步激活络氨酸酶，催化黑色素形成［1，6］。

近年来，国内外对于山羊MC1R基因的研究多集中于基因序列、基因结构、变异位点、mRNA表达差异等方面的研究，但对山羊MC1R基因的皮肤组织表达特征研究较少。笔者以太行山羊MC1R基因编码蛋白为研究对象，通过免疫组织化学方法，研究该蛋白在不同毛色太行山羊皮肤组织中的表达部位，以探讨其在不同毛色太行山羊体内的表达与太行山羊毛色发育之间的相关性，从而为太行山羊后期毛色的提纯选育提供依据，也为更加合理地利用太行山羊的毛色资源奠定基础。

图1 太行山羊皮肤组织横切面

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源：试验所用太行山羊均来自于山西省沁水县。用取皮器分别采集纯黑、纯白、黄褐和黑斑白色太行山羊皮肤组织。

1.1.2 试验试剂：4%甲醛固定液，无水乙醇，二甲苯，苏木精染液，0.1%酒精伊红液，1%盐酸—乙醇分化液，PBS缓冲液（pH值=7.4），一抗：人抗兔多克隆MC1R抗体，二抗：辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG SABC试剂盒，抗原修复液，DAB显色试剂盒。相关试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 太行山羊皮肤组织的HE染色：将不同毛色太行山羊的皮肤组织用4%的多聚甲醛溶液固定24 h，流水冲洗30min，然后在60℃恒温箱中利用不同梯度的乙醇溶液脱水：70%乙醇 （2 h），80%乙醇（过夜），85%乙醇（2 h），90%乙醇（60min），95%乙醇（60min），无水乙醇（45min），无水乙醇∶二甲苯（1∶1，20min）；然后用二甲苯透明 40min，再进行石蜡包埋，切片，烤片；之后按以下步骤对切片进行HE 染色：二甲苯Ⅰ（15min），二甲苯Ⅱ（15min），无水乙醇Ⅰ（5min），无水乙醇Ⅱ（5min），95%乙醇Ⅰ（5min），95%乙醇Ⅱ（5min），90%乙醇（5min），80%乙醇（5min），70%乙醇（5min），50%乙醇（5min），苏木精染色（5min），流水冲洗（2min），1%HCl-乙醇分化（10 s），1%氨水蓝化（2min），70%乙醇（3min），80%乙醇（3min），90%乙醇（3min），0.1%酒精伊红液染色（30 s），95%乙醇Ⅰ（3min），95%乙醇Ⅱ（3min），无水乙醇Ⅰ（3min），无水乙醇Ⅱ（3min），二甲苯Ⅰ（5min），二甲苯（5min）。

图2 太行山羊皮肤组织纵切面

1.2.2 太行山羊皮肤组织免疫组化技术：石蜡切片的制作过程同HE染色；之后分别用二甲苯Ⅰ（15min），二甲苯Ⅱ（15min），无水乙醇∶二甲苯（1∶1，5min）对切片进行脱蜡处理，再按以下步骤进行梯度酒精水化：无水乙醇Ⅰ（5min），无水乙醇Ⅱ （3min），95%乙醇Ⅰ （3min），95%乙醇Ⅱ（3min），90%乙醇（3min），80%乙醇（2min），70%乙醇（2min）；再用 PBS（pH 值=7.4）冲洗组织切片（3min×3次）；滴加3%的H2O2溶液，随后将切片放在加有PBS的湿盒内，置于37℃的烘箱中孵育20min，以消除内源性过氧化物酶的活性；在95℃恒温水浴锅中进行抗原修复15min；再用5%的BSA封闭液于37℃烘箱中孵育 40min；试验组滴加稀释的一抗（1∶100），4 ℃过夜，阴性对照组滴加 PBS；室温下平衡30min后 PBS（pH值=7.4）冲洗（3min×3次）；除去PBS缓冲液，滴加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗，37℃烘箱内孵育30min；PBS（pH值=7.4） 冲洗 （5min×3次） 后在切片上滴加DAB显色剂，37℃烘箱内显色5～8min，再用蒸馏水冲洗 （3min×3次）；苏木精轻度复染，随时观察；自来水冲洗（2min×2次）；再用梯度酒精进行脱水处理，二甲苯透明；最后用中性树胶封片，用PBS代替一抗体做阴性对照，细胞中出现棕黄色颗粒为染色阳性，根据显色有无分为阳性和阴性，用Olympus显微镜镜检拍照。

2 结果与分析

2.1 太行山羊皮肤组织结构 利用Olympus显微镜及Image-Pro PlusTM5.1图像分析系统观察太行山羊皮肤组织切片。从横切面观察（图1）发现，由外向内可分为表皮（C）、真皮（B）和皮下结缔组织（A）3层，并可以观察到一些毛囊结构（D）。从纵切面观察（图2）发现，每一个毛囊结构由毛乳头（A）、毛根（B）和毛囊组织（C）3部分构成。

图3 MC1R在太行山羊皮肤组织中的免疫组织化学染色结果

2.2 太行山羊MC1R蛋白在不同毛色太行山羊皮肤组织结构中的表达 免疫组化切片显微镜下观察可见，纯黑色和黄褐色太行山羊皮肤组织中试验组着色均明显（图3A和图3C），阴性对照组无特异染色（图3B和图3D）。试验组反应区主要集中在毛囊外根鞘组织，而纯白色山羊个体皮肤组织中试验组着色不明显，与阴性对照组几乎没有差别。上述结果表明，太行山羊MC1R蛋白主要分布于皮肤组织中毛囊周围的外根鞘组织，而且在纯黑色个体中的表达量最高。

3 讨论

3.1 山羊与绵羊皮肤组织结构比较 表皮对皮肤具有保护作用。王树迎等［7］通过测量山羊和绵羊的皮肤表皮层厚度，证实山羊（22.0～69.4 μm）皮肤的表皮层比绵羊（17.5～44.4 μm）厚。这可能是由于山羊的被毛较薄，外界各种刺激和摩擦容易直接接触表皮，因此，山羊的表皮细胞层次较多。从HE染色结果来看，太行山羊的真皮乳头层比网状层厚，这点与绵羊比较相似。王树迎等［7］研究表明，绵羊乳头层厚度占真皮厚度的67.97%，这与绵羊以产毛为主，因此其乳头层得到良好发育，网状层相对减弱有关。资料显示，太行山羊的羊绒生产性能较好，成年公羊平均抓绒量为275 g，平均剪毛量为400 g，因此其真皮乳头层也比较厚。无论是山羊还是绵羊，皮肤中三毛囊群所占比例均较高。太行山羊三毛囊群中毛囊的排列规律与辽宁绒山羊的排列规律相似。初级毛囊都位于毛囊群同一侧且与次级毛囊相间排列［8］。

3.2 关于MC1R基因及其编码蛋白在皮肤组织的表达部位及表达量 有研究发现，羊驼皮肤组织中的黑色素细胞主要分布于表皮、毛囊周围外根鞘组织、毛乳头及毛球周围［9］，且MC1R蛋白在棕色被毛中的表达量是白色被毛中的4.32倍［10］，表明MC1R基因表达的差异与羊驼的毛色表型间存在着相关性。存在该种相关性的原因可能是MC1R基因的表达量越多，就越能够激活更多的酪氨酸酶，进而促使黑色素细胞合成更多的黑色素，最终导致羊驼被毛颜色的加深。

太行山羊是皮肉兼用型品种［11］，主要分布于太行山东、西两侧的晋、冀、豫三省交界地区，具有体质健壮、放牧适应性强等特点。毛色以黑色为主，少数为褐、青、灰、白色。许多研究表明，MC1R基因在皮肤组织中表达。Böhm 等［12］和 Kauser等［13］研究发现，在皮肤色素形成过程中，MC1R蛋白主要表达于人表皮、毛囊周围外根鞘组织、真皮乳头及毛球周围。任玉红等［9］利用免疫组化技术研究发现，MC1R蛋白在白色和棕色羊驼皮肤组织中的表达部位与Böhm等［12］的研究结果一致，且MC1R在 2种毛色羊驼皮肤组织中的表达部位和表达量有所不同。该研究结果显示，MC1R蛋白在纯黑、黄褐、黑斑白色太行山羊个体中均有表达，表达部位集中于毛囊周围外根鞘组织，在表皮、真皮乳头和毛球周围不表达，这可能是由于太行山羊毛色形成机制与其他物种不同，具体原因仍有待进一步探究；MC1R蛋白在纯黑色个体中表达量最高，同时，纯白个体的试验组与阴性对照组相比无明显差异，这与该蛋白在毛色形成过程中的作用相对应。在猪的研究上也有类似发现，纯白个体的毛根和毛囊中均缺乏黑色素细胞及其前体［14］，也就是说MC1R蛋白在其皮肤组织中表达量较少。

4 结论

太行山羊的皮肤组织结构由外到内依次为表皮层、真皮层和皮下结缔组织。其中真皮层最厚，表皮层最薄。MC1R蛋白在太行山羊皮肤组织中的表达部位集中于皮肤组织毛囊周围的外根鞘组织，并且在纯黑色皮肤组织中的表达量最高，在纯白个体皮肤组织中未发现表达。在不同毛色个体中表达量的差异揭示太行山羊的毛色形成与MC1R蛋白的表达存在一定的相关性。

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Expression and Localization of MC1R in the Skin Tissues of Taihang Goats with Different Coat Colors

JING Jiong-jie，PAN Yang-yang，ZHANG Ying-jiao，MA Yuan，QIAO Li-ying，LIU Jian-hua
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

MC1R is one of the important candidate genes that are associated with the regulation of mammalian coat colors.Melanocortin 1 receptor （MC1R）is encoded by this gene which plays important roles in the metabolism of mammalian melanin.In the present study,the structures of skin from the black,white,brown and white with black-spots Taihang Goats were observed using the HE staining method,respectively.Immunohistochemistry assay was performed to study the expression of MC1R in the skins of goats with different coat colors.Results showed that the skins of the Taihang Goats consisted of epidermis,subdermal and subcutaneous connective tissue.No expression MC1R of was found in epidermis and subdermal in the tissues from goats with different coat colors.However,the expression MC1R was observed in the hair follicles of the black,brown and white with blackspots Taihang Goats which was mainly distributed in the outer root sheath.The results obtained in this study provide a basis for the further genetic selection of Taihang Goats.

Taihang Goats；skin tissues；MC1R；HE staining；immunohistochemistry

S827.952；Q344.13

A文章顺序编号：1672-5190（2016）08-0005-04

2016－07－10

项目来源：山西省研究生优秀创新项目（2015SY27）；山西省科技攻关项目（20120312010）；科技部863子课题（2011AA100307-05）。

景炅婕（1991—），女，博士研究生，主要研究方向为山羊分子遗传育种。

刘建华（1972—），女，副教授，博士，硕士生导师，主要研究方向为分子数量遗传与动物育种。

（责任编辑：赵俊利）