赤霉素处理对重楼种子萌发相关生理指标的影响

宋发军，罗　忠，黄　珍，孟艳艳，张　鹏

(中南民族大学 生命科学学院，生物技术国家民委重点实验室/武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉 430074)



赤霉素处理对重楼种子萌发相关生理指标的影响

宋发军，罗忠，黄珍，孟艳艳，张鹏*

(中南民族大学 生命科学学院，生物技术国家民委重点实验室/武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉 430074)

为分析赤霉素(GA3)处理对重楼种子萌发相关生理指标的影响，检测了500 mg/L 外源GA3处理以及对照处理的华重楼种子萌发过程中SOD、POD、CAT和G6PDH酶活性以及内源激素ZT、GA3、IAA和ABA含量的变化.结果表明：在90 d检测范围内，GA3处理种子的SOD活性达到最大值的时间(第30 d)早于对照组(第60 d)，CAT酶活性最高峰值高于对照组；而且，除第0 d样品外，GA3处理种子的G6PDH酶活性、CAT酶活性均大于对照组；GA3处理种子的ZT含量、内源GA3含量和IAA含量的最高峰值及其出现时间均高于和早于对照组；POD酶活性则均低于对照；GA3处理种子的ABA含量比对照下降幅度更大，最低值更小.可见500 mg/L 外源GA3处理促进了华重楼种子中SOD、CAT、G6PDH酶活性以及ZT、内源GA3和IAA含量的增加，降低了POD酶活性以及ABA含量.

华重楼；种子萌发；赤霉素；生理生化指标

重楼[ParispolyphyllaSmithvar.chinenensis(Franch.)Hand]是百合科(Liliaceae)重楼属(Paris)多年生草本植物，《神农本草经》中以“蚤休”之名记载，主要分布于湖北、云南、贵州、四川等地，具有抗菌抑菌、抗肿瘤、镇静镇痛、免疫调节等作用，市场需求量大.由于重楼资源的无序开发以及生态环境的破坏，导致重楼野生资源匮乏，重楼的人工繁育栽培是大量获得重楼药源植物的主要途径之一.

重楼的人工繁育包括根茎繁育和种子繁育.重楼种子繁殖具有繁殖系数大、生产成本低等优点，但也存在休眠期长，须经过形态学后熟和生理学后熟才能萌发[1，2]，以及自然发芽率低等问题[3].人工打破重楼种子休眠，提高其发芽率是实现大规模重楼种子人工繁育种植关键.相关研究表明赤霉素(Gibberellin A3，GA3)具有促进种子萌发的作用[4，5]，本实验前期工作发现500 mg/L GA3能有效打破华重楼种子休眠并促进其萌发[6].GA3处理后17 d华重楼种子开始萌发，与对照组(CK)(29 d萌发)相比，萌发时间提前了12 d；30 d时， GA3处理种子萌发率达到35.07%；50 d时，萌发率达到81.58%，而90 d时萌发率则高达95.19%.GA3促进华重楼种子萌发的机制尚不清楚，因此本文在前期工作基础上，分析了GA3处理华重楼种子萌发过程中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活性及玉米素(ZT)、赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)含量的变化规律，为深入研究GA3促进华重楼种子萌发的生理生化机理以及重楼种子的快繁研究提供参考.

1　材料和方法

1.1材料

2014年秋季采集于武陵山区试验田的成熟华重楼3年生种子，除掉颖壳以及红色外种皮，室温晾干后装入透气带，置于4℃冰箱低温处理3个月，备用.GA3、ZT、IAA和IBA购自Sigma公司.

1.2浸种处理

挑选籽粒饱满的华重楼种子两份，先用蒸馏水浸泡约48 h至种子吸水发胀变白为止.一份用500 mg/L赤霉素溶液浸泡48 h；另一份继续使用蒸馏水浸泡48 h作对照(CK).

1.3接种处理

浸种后，用75%乙醇消毒30～40 s，再用0.1%的升汞消毒10～12 min，并称取4 g种子作为第0 d样品，其余种子在铺有2层无菌滤纸的培养皿中培养，每皿100粒左右，培养温度(19±1 ) ℃，湿度80%，暗培养，并分别于培养的第15、30、45、60、90 d各取样4 g，-80 ℃保藏备用.

1.4指标测定

SOD、POD、CAT、G6PDH活性测定采用苏州科铭生物技术有限公司测试盒.内源激素的提取方法参照文献[7]并加以改进：称取1 g华重楼种子，加入0.1 g抗坏血酸和15 mL 80%预冷甲醇冰浴研磨成浆，转移至烧杯中4℃浸提24 h，4℃ 4000 r/min离心10 min，取上清液保存于4℃，残渣加入15 mL 80%冰冻甲醇，4℃浸提20 h，离心，合并上清液，35℃减压浓缩至原体积的1/3后，加入等体积乙酸乙酯-石油醚(1∶1，V/V)溶液萃取3次，收集水相萃取液，并加入0.1 g PVPP，20℃下震荡20 min，4℃ 10000 r/min离心10 min，取上清，1 mol/L柠檬酸调pH至3.0，30℃蒸干后，色谱甲醇溶解沉淀并定容至10 mL，过0.22 μm滤膜后用于HPLC检测.

内源激素检测：采用Agilent Technologies 1200 Series色谱仪，Venusil XBP C18色谱柱，柱温35℃，进样量10 μL，流速1 mL/min，紫外检测波长254 nm.流动相为甲醇-0.8%乙酸，梯度洗脱(0～12 min，5%～25%A；12～20 min，25%～50%A；20～40 min，50%A).保留时间定性，外标法定量.

1.5数据处理

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 16.0软件对数据进行作图和数据分析处理.

2　结果与分析

2.1GA3处理对种子萌发过程中SOD酶活性的影响

SOD是植物体内清除氧自由基的主要酶类， SOD活性强弱在某种程度上可以反映种子的活力[8].由图1可知，GA3处理种子的SOD活性呈先升高后降低再升高的趋势，于第30 d达到最大值23.38 U/g，而对照组SOD活性呈双峰变化趋势，最高峰值出现在第60 d(23.23 U/g)，说明GA3处理导致华重楼种子的SOD活性最大值的出现时间早于对照；而且，在15、30、45和90 d检测点的SOD活性高于对照，也表明GA3处理可以促进华重楼种子SOD的合成.显著性分析结果表明，GA3处理种子的SOD活性在第0、15、60 d与对照组存在差异极显著性(p<0.01)，在第30 d差异显著(p<0.05).可见高的SOD活性是与GA3促进华重楼种子萌发相关的一个生理生化指标.

图1　华重楼种子萌发过程中SOD酶活性变化Fig.1　The change of SOD activity in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

2.2 GA3处理对种子萌发过程中POD酶活性的影响

POD既是植物体内清除氧自由基的酶类，同时还参与植物体内吲哚乙酸的氧化分解.图2表明，GA3处理组及对照组种子POD活性均呈先降低后升高的趋势，最小值分别出现在第30 d和第15 d.GA3处理种子POD活性从第0 d(62931.31 U/g)降至第30 d(32802.99 U/g)，随后一直升高至90 d(47280.52 U/g，低于第0 d)；而对照组POD活性由第0 d(61995.55 U/g)降至第15 d(36546.11 U/g)，之后，持续升高至第90 d(62931.31 U/g，略高于第0 d).在0、30、45、60和90 d 检测点GA3处理种子POD酶活性均低于对照，说明GA3处理会抑制华重楼种子体内POD活性.显著性分析结果表明，GA3处理种子的POD活性在第30，45和60 d与对照组间存在显著差异(p<0.05)；在第90 d差异极显著(p<0.01).因此低的POD活性是与GA3促进华重楼种子萌发相关的一个生理生化指标.

图2　华重楼种子萌发过程中POD酶活性变化Fig.2　The change of POD activity in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

2.3GA3处理对种子萌发过程中CAT酶活性的影响

CAT的主要作用是防止过量的过氧化氢对细胞膜系统的毒害以及对脂质的氧化，减少过氧化氢对植物的伤害.图3表明，GA3处理组和对照组种子的CAT酶活性均呈先升高后降低的趋势，GA3处理和对照组种子的CAT酶活性最高峰值分别出现在第30 d(1409.06 U/g)和第15 d(573.58 U/g)，GA3处理种子的CAT酶活性最高峰值约是对照组的1.83倍，而且从第15 d至第90 d的各个检测点，GA3处理种子的CAT酶活性均高于对照组，说明GA3处理可以更有效的提高华重楼种子的CAT活性，从而为种子快速萌发提供有利的条件.显著性分析结果表明，GA3处理种子的CAT活性除第0 d外均与对照组存在极显著差异(p<0.01).这些结果预示CAT活性升高与重楼种子的快速萌发有紧密的联系，高CAT活性是与GA3促进华重楼种子萌发相关的一个生理生化指标.

图3　华重楼种子萌发过程中CAT酶活性变化Fig.3　The change of CAT activity in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

2.4GA3处理对种子萌发过程中G6PDH酶活性的影响

戊糖磷酸途径与植物的生长发育密切相关，而G6PDH是戊糖磷酸途径限速酶之一.图4可看出，处理组和对照组种子的G6PDH活性呈先上升后降低再上升的趋势，分别于第15 d达到峰值(160.41 U/g和118.73 U/g)，之后，G6PDH活性开始下降.GA3处理种子的G6PDH活性于第30 d后又开始上升，于第90 d达到171.58 U/g；而对照处理种子G6PDH活性于第45 d后开始上升，至第90 d达到87.34 U/g.在90 d检测范围内，GA3处理种子的G6PDH酶活性均高于对照组，说明GA3处理能够增强华重楼种子体内G6PDH活性.显著性分析结果表明，在第15、45、60和90 d检测点，GA3处理种子与对照组G6PDH活性存在显著差异(p<0.05).同样G6PDH活性是GA3促进华重楼种子萌发相关的一个生理生化指标.

图4　华重楼种子萌发过程中G6PDH酶活性变化Fig.4　The change of G6PDH activity in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

2.5GA3处理对种子萌发过程中ZT含量的影响

玉米素(ZT)是一类细胞分裂素，ZT含量的提高有助于打破种子休眠[9].由图5可见，GA3处理种子的ZT含量表现为先升高后降低的趋势，于第30 d检测点达到最高峰值(13.70 ng/g)，之后开始降低，并于第90 d检测点时接近初始水平(第0 d)，说明此时重楼种子的萌发已无需过多的ZT参与.对照组种子的ZT含量呈现双峰的趋势，分别在第30 d(10.04 ng/g)和第60 d(13.17 ng/g)出现峰值，在第90 d检测点时仍高于初始水平.在0～45 d检测点，GA3处理种子的ZT含量一直高于对照，而且ZT含量的最高峰值出现时间(30 d,13.70 ng/g)早于和高于对照组(60 d,13.17 ng/g)，预示GA3处理能够促进华重楼种子提前合成大量ZT，从而有助于其萌发.显著性分析结果表明，GA3处理组与对照组的ZT含量在第30、45、60和90 d差异极显著(p<0.01).因此高含量ZT是与GA3促进华重楼种子萌发相关的一个生理生化因子.

图5　华重楼种子萌发过程中ZT含量变化Fig.5　The content of ZT in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

2.6GA3处理对种子萌发过程中内源GA3含量的影响

GA3促进萌发的作用表现在两方面：一是解除脱落酸的抑制作用，二是诱导物质与能量代谢相关水解酶的合成与分泌[10,11].图6表明，GA3处理和对照处理种子的内源GA3含量均呈先降低后升高再降低再升高的趋势.GA3处理种子和对照组种子的内源GA3含量第一个峰值分别出现在第30 d(455.78 ng/g)和第45 d(442.76 ng/g)，说明GA3处理华重楼种子的内源GA3含量的峰值早于和高于对照组.之后，内源GA3含量下降，GA3处理组种子和对照组种子的内源GA3含量分别于第45 d检测点和第60 d检测点开始上升，GA3处理种子的内源GA3含量于第90 d检测点达到最大值496.98 ng/g，而对照处理种子第90 d检测点的内源GA3含量低于其初始水平(第0 d)，表明GA3处理能够更有效的促进华重楼种子内源GA3的合成.显著性分析结果表明，GA3处理组与对照组间除第0 d外，其余5个检测点差异均极显著(p<0.01).可见高的内源GA3含量是与华重楼种子快速萌发相关的一个生理生化因子.

图6　华重楼种子萌发过程中内源GA3含量变化Fig.6　The content of endogenous GA3 in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

2.7GA3处理对种子萌发过程中IAA含量的影响

图7　华重楼种子萌发过程中IAA含量变化Fig.7　The content of IAA in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

吲哚乙酸(IAA)是自然界中存在最广泛的生长素，具有能促进细胞核的分裂及细胞的伸长的作用.图7表明，GA3处理组和对照组种子的IAA含量均呈先降低后升高再降低再升高的趋势.GA3处理组种子和对照组种子的IAA含量第一个峰值分别出现在第30 d检测点(63.41 ng/g)和第45 d检测点(46.51 ng/g)，说明GA3处理华重楼种子的IAA含量的峰值早于和高于对照处理.之后，IAA含量下降，随后GA3处理组种子和对照组种子的IAA含量又分别于第45 d和第60 d上升，GA3处理种子的IAA含量于第90 d检测点达到最大值74.18 ng/g，而对照处理种子的第90 d检测点的IAA含量低于其初始水平(第0 d)，说明GA3处理能够更有效的促进华重楼种子IAA的合成.显著性分析结果表明，GA3处理种子与对照处理种子间在第30 d和第45 d差异极显著(p<0.01).这些结果预示高的IAA含量与GA3促进华重楼种子萌发的具有一定的关联.

2.8GA3处理对种子萌发过程中ABA含量的影响

脱落酸(ABA)能诱导种子休眠，具有抑制萌发和胚芽鞘伸长的生理效应，与赤霉素之间存在拮抗作用[12].由图8可知，处理组的ABA含量呈下降的趋势，于第90 d达到最低值5.92 ng/g；而对照组的ABA含量整体呈下降趋势，但在第30 d检测点后开始上升至第45 d(9.09 ng/g，低于初始水平)，并于第90 d达到最低值7.23 ng/g.在90 d的检测范围内，处理组ABA含量下降幅度更大，而且ABA含量的最低值小于对照组，表明GA3处理可以显著降低华重楼种子内ABA含量.显著性分析结果表明，GA3处理种子与对照组种子在第15、90 d存在差异极显著(p<0.01)，在第30、45、60 d存在差异显著(p<0.05).可见低的ABA含量是GA3促进华重楼种子萌发相关的一个生理生化因子.

图8　华重楼种子萌发过程中ABA含量变化Fig.8　The content of ABA in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

3　结语

种子萌发过程中伴随着一系列复杂而有序的生理变化，包括储藏物质的转化与利用、呼吸代谢作用、质膜的抗氧化等，检测参与这些生理活动的酶类的变化规律有助于揭示种子萌发的生理生化机制.本研究发现GA3处理华重楼种子萌发过程中SOD、CAT、G6PDH酶活性增加，POD酶活性降低.预示GA3促进华重楼种子萌发可能与高的SOD、CAT、G6PDH酶活性以及低的POD酶活性有关.

内源激素含量的变化与种子萌发存在紧密联系，各种激素能够诱导储藏物质的分解与合成并最终导致种子的萌发[13].本研究表明外源GA3有可能通过

更有效的促进华重楼种子大量合成ZT、内源GA3和IAA，同时降低ABA含量，从而促进华重楼种子萌发.

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Effect of Exogenous Gibberellic Acid on the Physiological and Biochemical Factors in the Germination Process ofParispolyphyllavar.chinensisseeds

SongFajun,LuoZhong,HuangZhen,MengYanyan,ZhangPeng

(National Committee Key Laboratory for Biotechnology / Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plant Germplasm in Wuling Area of China, College of Life Sciences,South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

In order to reveal the influence of exogenous Gibberellic acid (GA3) on the physiological and biochemical factors in the germination process ofP.polyphyllaseeds, the activity of SOD, POD, CAT, G6PDH and the content of ZT, endogenous GA3, IAA, ABA were detected in the germination process ofP.polyphyllaseeds treated with 500 mg/L endogenous GA3and mocked-treated with H2O as control.Results: In the 90 days range, the appearance time of the highest SOD activity in GA3-treated seeds (day 30) was earlier than the control (day 60), the highest CAT activity in GA3-treated seeds was higher than the control, and the activity of G6PDH and CAT in GA3-treated seeds was higher than the control except in the day 0 samples. The highest content and its appearance time of ZT, endogenous GA3, IAA in GA3-treated seeds were higher and earlier than the results of the control. However, the POD activity in GA3-treated seeds was lower than that of the control, and the decreasing extent and the minimum content of ABA in GA3-treated seeds was more significant and lower than the results of the control. Conclusions: Treatment with 500 mg/L exogenous GA3led to increase the activity of SOD, CAT, G6PDH and the content of ZT, endogenous GA3, IAA, in the meanwhile, and decrease the POD activity and the ABA content in GA3-treatedP.polyphyllaseeds.

Parispolyphyllavar.chinensis; seed germination; gibberellic acid; physiological and biochemical factors

2016-04-14*通讯作者张鹏，研究方向：药用植物及其内生菌, E-mail: zhangpenghust@126.com

宋发军(1967-)，男，教授，研究方向：应用生物化学，E-mail：songfajun@scuec.edu.com

国家自然科学基金资助项目(31370118)；中南民族大学基本科研业务费专项资金资助项目(CZW15019)；校企合作项目(HZY14024)；中南民族大学大学生创新创业资助项目(GCX15006; SCX15004);湖北省生物技术专业综合改革试点项目(GJZ15006)

Q945.4

A

1672-4321(2016)03-0030-05