斑马鱼母源凝集素基因zfol的克隆和表达分析

王红莹, 杜　嫚

(中南民族大学 生命科学学院，武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074)



斑马鱼母源凝集素基因zfol的克隆和表达分析

王红莹, 杜嫚

(中南民族大学 生命科学学院，武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074)

为验证凝集素Zfol是否为母源蛋白及其具体表达模式，揭示凝集素这类来源于母体的免疫物质在鱼类胚胎发育早期的免疫保护作用并提供理论依据，克隆Zfol 的基因全长进行了生物信息学分析.利用RT-PCR和Western blot分析了zfolmRNA和Zfol蛋白的时空表达.结果表明：zfolmRNA及Zfol蛋白在斑马鱼胚胎发育过程中的表达均呈动态变化.zfolmRNA在成鱼的卵巢、心脏、肝脏、肾脏、脑中表达，在精巢中未检测到表达.Zfol蛋白在精巢、心脏、脑、肝脏等组织中检测不到表达，而在肾脏中有低含量表达，在卵巢中有高含量表达.

凝集素；斑马鱼； 基因zfol； 克隆；表达分析

凝集素是动、植物体内一种重要组分，作为一类能识别并结合糖基的蛋白质，可结合致病源表面糖蛋白或糖缀合物，在识别致病源、抑制细菌增殖、阻止卵子多精受精、调节糖类物质代谢等过程中发挥重要作用类在[1-4].早期胚胎发育过程中依赖母源免疫和自身非特异免疫.卵母细胞中有一些凝集素来源于母体，可能是鱼体的先天免疫因子，在鱼类还没发育成熟时保护早期胚胎避免病原入侵[5-8].研究卵母细胞特异的凝集素功能有助于深入了解胚胎发育早期的免疫保护机制[7,9,10].与其他鱼类相比，作为模式生物的斑马鱼(Daniorerio)早期胚胎发育细胞分裂快速、饲养简便、遗传背景清晰、遗传操作技术成熟等，这些特点为本研究的顺利开展提供了可能.

本文以克隆斑马鱼基因zfol为切入点，在生物信息学分析基础上，在mRNA水平和蛋白质水平分别分析了zfol在胚胎发育过程中及各组织中的表达差异，为进一步对其进行功能研究奠定了基础.

1　材料和方法

1.1材料

供试材料：野生型斑马鱼在(28±0.5)℃循环水养殖系统中饲养，每天早晚各投喂饵料1次，控制光照(14 h照明/10 h黑暗)的明暗周期照明.需要收集胚胎时，于前一天将雌雄斑马鱼按照只数2∶1比例放置在同一繁殖缸内，中间用隔板隔开，第二天光照前去掉插板，待斑马鱼开始追尾，约20～40 min后开始产卵，收集受精卵，胚胎用水清洗后，置于ERS培养液，放置于(28±0.5)℃培养箱中培养.

1.2试剂

限制性内切酶、KOD试剂盒、Taq酶(日本TakaRa)，T4 DNA 连接酶、M-MLV 逆转录酶(美国Promega)，Trizol regent(美国Invitrogen)，抗体(上海Abmart)，凝胶回收试剂盒(上海华舜)，质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒(上海生工).

1.3RNA的提取和cDNA合成

取斑马鱼胚胎，利用TRIZOL方法提取总RNA.利用MMLV反转录成cDNA.

1.4目的基因zfol克隆和mRNA水平检测

克隆zfol基因的引物：F：5′-ATGAAGGTTTATC

AAGGTGTTTTG-3′，R：5′-TTATAGAGTACATTTACG

GATG-3′.β-actin作为内参，引物如下：F： 5′-CTTGCGGTATCCACGAGAC-3′，R：5′-GCGCCATACA

GAGCAGAA-3′. PCR产物与pGEM-T Vector 相连接，转化JM109大肠杆菌中，利用菌落PCR鉴定是否插入正确，测序.zfol转录水平检测采用RT-PCR方法，引物同上.

1.5Western blot 检测Zfol蛋白的时空表达模式

受精后的斑马鱼胚胎观察，选取不同发育时期的胚胎进行收集.斑马鱼成鱼中，选取不同组织，将以上样品分别用 RIPA裂解液裂解，随后采用Western blot 方法检测Zfol的不同发育时期和不同组织中的表达模式.

2　结果

2.1zfol克隆测序及序列分析

PCR扩增后经测序验证得到zfol的开放阅读框序列(图1).经生物信息学检测，zfol基因编码256个氨基酸.其5′非翻译区的长度为73 bp，3′非翻译区的长度为93 bp，有完整的poly A尾巴，基因的cDNA全长为937 bp.以上结果表明zfol基因编码完整的蛋白.

图1　凝胶电泳检测zfol基因 Fig.1　Agarose gel electrophoresis detection of zfol gene

图2　测序结果和对应的氨基酸序列Fig.2　Sequencing result and correspongding amino acid sequences

2.2zfolmRNA表达量在不同发育时期的胚胎中的变化

为研究凝集素zfol是否为母源蛋白，及其在鱼类的早期胚胎发育过程中的模式，采用RT-PCR方法检测了其在斑马鱼受精后不同胚胎发育时期的mRNA表达量的变化(图3).以β-actin为标准来检测各个时期所用的总RNA量是否一致.RT-PCR分析结果显示zfol在受精后的各个发育时期均有表达.从发育起始就有高含量表达，说明其是来自母体遗传，为母源蛋白，表达量受精后到16 hpf一直较高，后期随着胚胎的进一步发育，母体蛋白影响变小，zfol的mRNA表达量下降，到36 hpf后，随着胚胎的分裂发育，新生胚胎自身的mRNA及蛋白大量表达，zfol的表达量有所上升.

图3　受精后斑马鱼胚胎发育不同时期的zfol mRNA表达水平Fig.3　Temperal expression of zfol mRNA in different periods during zebrafish embryogenesis

2.3在成体斑马鱼不同组织中zfol转录水平表达变化

不同组织的定位预示着不同的功能实验利用RT-PCR方法研究了斑马鱼成鱼中不同组织中zfol的表达变化(图4)，结果显示组织表达中，zfolmRNA在成鱼的卵巢、心脏、肝脏、肾脏、脑中有表达，在精巢中未检测到表达.

图4　斑马鱼成鱼各组织中zfol mRNA表达水平Fig.4　zfol mRNA expression level in each indicated tissues of zebrafish

2.4Zfol蛋白在斑马鱼各发育早期的表达水平变化

蛋白起始表达时期、表达量的多少预示了是否是母源蛋白.实验以β-Tubulin作为标准内参，应用Western blot方法检测Zfol蛋白表达情况(图5).在受精后最初的4 h内，Zfol含量非常高，此时期新生胚胎自身的蛋白尚未开始大量表达.说明此时的Zfol来自母体.此后蛋白含量出现动态变化，母体蛋白逐渐耗尽，在受精后约6 h，蛋白含量回落，表达量下降.12～16 h蛋白含量有小幅上升，20～24 h表达量再次回落，到36 h蛋白表达量升至最高，此后Zfol蛋白含量剧烈下降.故斑马鱼受精后早期胚胎发育的96 h内，Zfol蛋白表达呈现动态波动变化.

0～96 hpf：斑马鱼胚胎受精后0～96 h图5 Zfol蛋白在斑马鱼各发育早期的表达水平Fig.5　Zfol expression levels at each early developmental stages of zebrafish

2.5在成体斑马鱼不同组织中Zfol蛋白水平表达模式

不同组织的蛋白定位直接与蛋白的功能相关，采用Western blot检测了Zfol在斑马鱼成体鱼不同组织中的表达模式(图6).结果表明：Zfol蛋白在精巢、心脏、脑、肝脏等组织中检测不到表达，而在肾脏中有低含量表达，在卵巢中有高含量表达.

图6　斑马鱼不同组织中Zfol 蛋白的表达水平Fig.6　Zfol expression level in different tissues of zebrafish

3　讨论

凝集素基因zfol是否为母源基因及其具体表达模式是本研究关注的要点.鱼类各组织中尤其是卵母细胞中有一些凝集素来源于母体.在卵母细胞的成熟过程中及受精后的早期胚胎发育过程中，这些凝集素的功能可能与免疫保护相关，属于母源垂直传递的母源免疫.为研究克隆基因zfol是否为母源基因，揭示其分布模式和表达模式，实验克隆得到了该基因全长，生物信息学分析表明该基因的cDNA编码一个全序列的功能蛋白.在斑马鱼受精后的早期胚胎发育时期，该基因的mRNA及蛋白在斑马鱼胚胎发育过程中的表达均呈动态变化，且在受精后的前几个小时表达量很高.在成鱼组织中，卵巢的表达量最高.说明zfol基因和蛋白在母体就存在，并随着鱼的产卵，经卵母细胞垂直传递给新生个体.因此在受精后的几小时内，新生个体自身的基因和蛋白还没大量表达时，zfol基因和蛋白的含量处于高表达.因此zfol基因是母源基因，其编码的蛋白质是母源凝集素蛋白.

此外，zfolmRNA在成鱼的卵巢、心脏、肝脏、肾脏、脑中有表达，在精巢中未检测到表达.Zfol蛋白在精巢、心脏、脑、肝脏等组织中检测不到，而在肾脏中有低含量表达，在卵巢中有高含量表达.这可能是翻译水平存在调控，因此造成mRNA和蛋白检测结果的差异.zfolmRNA及Zfol蛋白在斑马鱼胚胎发育过程中的表达均呈动态变化，说明基因和蛋白的调控是多层次和多方面的.在转录、剪接、翻译以及翻译后修饰等过程中，存在多方面的复杂调控，以保证基因在个体的不同生长发育时期和不同组织器官中的精确表达.

本文对斑马鱼凝集素基因zfol在早期不同发育时期和成体不同组织器官中的转录和蛋白表达情况进行了检测分析，结果表明其是母源凝集素蛋白.凝集素被认为是来自母体的有的会对胚胎发挥免疫保护功能[7,10,11].由zfol基因在斑马鱼胚胎发育早期的转录和蛋白表达谱，获知了其发挥重要功能的关键时期，为后续进一步研究其功能奠定了基础.

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Molecular Cloning and Characterization of Maternal Lectin Genezfolin Zebrafish

WangHongying,DuMan

(Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plant Germplasm in Wuling Area of China ,College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities of Life Science,Wuhan,430074)

To investigate the expression pattern of maternal lectin Zfol, and to provide the theoretical basis for immune protection effect of lectins from the mother′s immune material on embryogenesis, the full-length ofzfolgene was cloned and the expression pattern was characterized. Bioinformatics analysis tozfolwas also performed. The spatial-temporal expression pattern ofzfolmRNA and protein levels was determined by RT-PCR and Western blot, respectively. The results indicated that bothzfolmRNA and Zfol proteins showed dynamic expression pattern during zebrafish embryogenesis. High level expression ofzfolmRNA were detected in the liver, kidney, ovary, brain, and heart except testis in adult fish; whereas, Zfol protein was highly expressed in ovary, less expressed in kidney, and not expressed in testis, heart, brain and liver.

lectin; zebrafish;zfol;cloning;expression analysis

2016-04-04

王红莹 (1976-), 女, 副教授, 博士, 研究方向: 水生生物学、分子生物学, E-mail: wanghongying@mail.scuec.edu.cn

国家自然科学基金资助项目(31001099)

S965.299

A

1672-4321(2016)03-0026-04