薯蓣丸抗I型变态反应作用及其机理研究

黄腾炜，洪 蕾

（1.重庆医科大学中医药学院2013级硕士研究生，重庆 400016；

2.重庆医科大学中医药学院，重庆 400016）

薯蓣丸抗I型变态反应作用及其机理研究

黄腾炜1，洪 蕾2

（1.重庆医科大学中医药学院2013级硕士研究生，重庆 400016；

2.重庆医科大学中医药学院，重庆 400016）

目的：探讨薯蓣丸抗I型变态反应作用及其机制。方法：以卵白蛋白为变应原制备大鼠I型变态反应模型，制备抗卵白蛋白的抗血清（含IgE），采用大鼠同种被动皮肤过敏反应（PCA）实验法观察测定各组动物蓝斑直径、蓝斑光密度（OD）及蓝斑抑制率；以抗卵白蛋白血清被动致敏的大鼠颅骨肥大细胞模型观察对肥大细胞脱颗粒的影响；通过Elisa法检测I型变态反应模型大鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE含量变化的影响。结果：薯蓣丸蜜丸可明显抑制大鼠同种PCA反应，降低Ⅰ型变态反应模型大鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE含量。结论：薯蓣丸蜜丸有抗Ⅰ型变态反应的作用，其机制可能是通过促进IFN-γ分泌、降低IL-4及IgE含量、调节Th1/Th2细胞因子水平完成的。

薯蓣丸；I型变态反应；IL-4；IFN-γ

荨麻疹是皮肤科临床常见的I型变态反应性疾病，是由于皮肤、黏膜小血管扩张及渗透性增加而出现的一种局限性水肿反应，主要表现为风团反复发作，伴随剧烈瘙痒等。病情顽固，迁延不愈，因其发病涉及到多种的介质和细胞，病因及病理机制非常复杂，我们观察薯蓣丸治疗慢性荨麻疹临床疗效及其安全性，结果发现薯蓣丸治疗围绝经期女性慢性荨麻疹疗效好，复发率低，不良反应少［1］。现将薯蓣丸抗I型变态反应作用及其机理研究总结如下。

1　材 料

1.1实验动物

健康SD大鼠，雌雄各半，体质量180～220g，由重庆医科大学实验动物房提供。大鼠在SPF实验环境中适应性常规喂养5天。

1.2实验药物与试剂

薯蓣丸蜜丸（重庆桐君阁中药材市场加工）［2］，氯苯那敏片（广东南国药业有限公司，批号120803），卵白蛋白（SIGMA公司生产，重庆鸿兵生物技术有限公司进口分装，批号201412），百白破疫苗（成都生物制品研究所提供，批号20120421-1），伊文思蓝（BBI公司生产，重庆鸿兵生物技术有限公司进口分装，批号201507），中性红（SIGMA公司生产，重庆鼎国生物有限公司进口分装，批号201204626215）IL-4、IFN-γ、IgE酶联免疫法检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。

薯蓣丸由山药、当归、桂枝、神曲、干地黄、豆黄卷、甘草、人参、川芎、芍药、白术、麦门冬、杏仁、柴胡、桔梗、茯苓、阿胶、干姜、白蔹、防风、大枣组成，药材均购于重庆市桐君阁中药材加工专业市场，经重庆医科大学中医药研究室鉴定为正品药材。药材按《金匮要略》记载的比例配伍后通过适当粉碎，取3倍量水浸泡约0.5h后武火煮沸，文火煎煮20min，通过2次煎煮，将2次所得滤液合并，盛放并静置，取上清液水煎后进行浓缩提取，滤液浓缩至原生药含量3.2g/mL，置于4℃冰箱低温备用。每次制备2日用药量，浓缩后2天内用完，临时用蒸馏水稀释。

据《药理实验方法学》“不同动物等效剂量折算系数表”将成人（70kg）每日所需用药量换算成大鼠（kg）所需药量，并以此剂量设为实验中剂量。计算公式为D大鼠=K·D人。D大鼠为200g大鼠每日所需药量，K为折算系数，人与大鼠间的折算系数为0.018，D人为70kg成人每日所需药量。薯蓣丸低、中、高剂量组给药比例设置为1∶2∶4。低剂量组给予经方薯蓣丸浓缩水煎剂15.25g/（kg·d），中剂量组给予经方薯蓣丸浓缩水煎剂30.5g/（kg·d），高剂量组给予经方薯蓣丸浓缩水煎剂61g/（kg·d）。

1.3实验主要仪器

80-2型低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），721B型分光光度计（上海第三分析仪器厂），Sartorius微量天平，生物显微镜（OLYMPUS）。

2　方 法

2.1薯蓣丸对大鼠同种被动皮肤过敏试验（PCA）反应的影响

抗卵白蛋白血清的制备：取大鼠6只，将1%卵白蛋白生理盐水溶液按0.5mL，肌内注射于后腿两内侧，同时每只腹腔注射百白破疫苗0.2mL，第13天（IgE高峰期）将动物用乙醚麻醉后，腹主动脉取血，2000r/min离心10min，分离取得卵白蛋白抗IgE血清，置冰箱备用。

被动皮肤致敏：取大鼠60只，称重，按体质量随机分为6组，每组10只，雌雄各半，即正常对照组、模型组、氯苯那敏组（0.17mg/kg），薯蓣丸蜜丸低剂量组（15.25g/kg）、薯蓣丸蜜丸中剂量组（30.5g/kg）、薯蓣丸蜜丸高剂量组（61g/kg）。正常对照组和模型对照组灌服生理盐水，其余组分别予以灌服相应药物的生理盐水溶液。于分组给药后的第6天用乙醚浅麻醉，在大鼠背中线两侧，距脊柱1.5cm处，将毛剪光，每侧取2个点，两点间隔2cm，左右侧分别皮内注射1∶5，1∶10稀释的含IgE抗血清0.1mL。48h后进行抗原攻击，尾静脉注射0.5%伊文思蓝溶液1mL，内含卵白蛋白1mg。经30min后剪下背部皮肤，检测注射各点的蓝色反应斑直径，随后剪下蓝色皮肤斑，剪碎置5mL丙酮生理盐水混合溶液中（7∶3）浸泡48h，2000r/min离心，取上清液，在610nm波长处测定吸光度（OD值）。

抑制百分率=（1-给药组平均吸光度值/模型组平均吸光度值）×100%

2.2薯蓣丸对大鼠颅骨骨膜肥大细胞脱颗粒试验的影响

IgE血清制备：与抗卵白蛋白血清的制备相同。取大鼠60只，称重，按体质量随机分为6组，每组10只，雌雄各半，即正常对照组、模型组、氯苯那敏组（0.17mg/ kg），薯蓣丸蜜丸低剂量组（15.25g/kg）、薯蓣丸蜜丸中剂量组（30.5g/kg）、薯蓣丸蜜丸高剂量组（61g/ kg）。正常对照组和模型对照组灌服生理盐水，其余组分别予以灌服相应药物的生理盐水溶液。于分组给药后的第6天，各组动物每只头部皮下注射1∶20稀释的含IgE血清0.1mL。致敏后48h，尾静脉注射1%卵白蛋白生理盐水溶液和1%伊文思蓝各1mL，经30min后处死动物。切开头部皮肤剥离剪下颅骨，置于95%乙醇中1h后取出，放入无水甲醇中过夜。然后以0.18%中性红酒精溶液染色30min，用水冲洗后剥离颅骨骨膜，展开铺于载玻片上，干燥，加盖玻片，封固置于显微镜高倍镜下观察。每张切片随机选取不重复视野，细胞边缘光滑、胞内颗粒分布均匀的为正常肥大细胞，胞膜破裂、颗粒溢出的为脱颗粒肥大细胞。按以下公式计算肥大细胞脱颗粒率和脱颗粒抑制率。

肥大细胞脱颗粒率（%）=脱颗粒肥大细胞数/肥大细胞总数×100%

肥大细胞脱颗粒抑制率抑制率（%）=（1-给药组肥大细胞脱颗粒率/模型组肥大细胞脱颗粒率）×100%

2.3薯蓣丸对大鼠血清IL-4、IFN-γ、IgE含量变化的影响

大鼠60只，称重，按体质量随机分为6组，每组10只，雌雄各半，即正常对照组、模型组、氯苯那敏组（0.17mg/kg），薯蓣丸蜜丸低剂量组（15.25g/kg）、薯蓣丸蜜丸中剂量组（30.5g/kg）、薯蓣丸蜜丸高剂量组（61g/kg）。正常对照组和模型对照组灌服生理盐水，其余组分别予以灌服相应药物的生理盐水溶液。以生理盐水配制氢氧化铝悬液（10mg/mL），正常对照组大鼠腹腔注射1mL/只，其余各组大鼠腹腔注射卵白蛋白（lmg）与氢氧化铝悬液（1mL）的混合液进行初次免疫，第10天重复1次。初次免疫后第6天，灌胃给药。其中正常对照组给予等量生理盐水，日1次，持续9日。末次给药2h后，大鼠腹主动脉取血，2000r/ min离心10min，取血清，分装，-20℃保存。采用大鼠IL-4、IFN-γ、IgE酶联免疫试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作，分别测定血清中IL-4、IFN-γ、IgE的吸光度，根据标准曲线，计算浓度，并比较IFN-γ/IL-4值的变化。

2.4统计学方法

3　结 果

薯蓣丸对大鼠同种被动皮肤过敏试验（PCA）反应的影响见表1。

表1　薯蓣丸对大鼠同种被动皮肤过敏（PCA）反应的影响 （±s）

表1　薯蓣丸对大鼠同种被动皮肤过敏（PCA）反应的影响 （±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01，○P＜0.05。

组别nOD值抑制率（%）1∶51∶101∶51∶10正常对照组100.018±0.010.015±0.011模型组100.878±0.270*0.456±0.191*氯苯那敏组100.302±0.104#0.195±0.133#（65.60）（57.24）薯蓣丸蜜丸低剂量组100.569±0.115#0.301±0.147（35.19）（33.99）薯蓣丸蜜丸中剂量组100.421±0.175#0.251±0.116○（52.05）（44.96）薯蓣丸蜜丸高剂量组100.316±0.109#0.191±0.109#（64.01）（58.11）

薯蓣丸对大鼠颅骨骨膜肥大细胞脱颗粒试验的影响见表2。

表2　薯蓣丸对大鼠颅骨骨膜肥大细胞脱颗粒试验的影响 （±s）

表2　薯蓣丸对大鼠颅骨骨膜肥大细胞脱颗粒试验的影响 （±s）

注：与模型组比较，#P＜0.01；与正常对照组比较，*P＜0.01。

组别n肥大细胞脱颗粒抑制率（%）正常对照组1010±3.18模型组1067±7.58*氯苯那敏组1032±6.55#（52.24）薯蓣丸蜜丸低剂量组1055±6.32#（17.91）薯蓣丸蜜丸中剂量组1044±7.02#（34.33）薯蓣丸蜜丸高剂量组1035±5.38#（47.76）

薯蓣丸对大鼠血清IL-4、IFN-γ含量的影响见表3。

表3　薯蓣丸对大鼠血清IFN-γ、IL-4含量的影响 （pg/mL，±s）

表3　薯蓣丸对大鼠血清IFN-γ、IL-4含量的影响 （pg/mL，±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01，○P＜0.05。

组别nIFN-γIL-4IFN-γ/IL-4正常对照组1049.72±7.1220.02±5.112.48±0.59模型组1037.60±6.34*30.01±6.45*1.25±0.38氯苯那敏组1048.87±7.56#22.33±4.23#2.19±0.79#薯蓣丸蜜丸低剂量组1040.32±6.7526.31±5.571.53±0.31薯蓣丸蜜丸中剂量组1045.68±7.69○24.12±6.06○1.89±0.57#薯蓣丸蜜丸高剂量组1049.02±8.19#20.97±5.35#2.34±0.53#

薯蓣丸对大鼠血清IgE含量的影响见表4。

表4　薯蓣丸对大鼠血清IgE含量的影响 （Iu/mL，±s）

表4　薯蓣丸对大鼠血清IgE含量的影响 （Iu/mL，±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01，○P＜0.05。

组别nIgE正常对照组1012.66±3.14模型组1034.55±6.21*氯苯那敏组1015.39±3.90#薯蓣丸蜜丸低剂量组1028.77±5.930薯蓣丸蜜丸中剂量组1025.22±4.18#薯蓣丸蜜丸高剂量组1016.34±5.56#

4　讨 论

I型变态反应性疾病发病的两个主要阶段即致敏阶段和发敏阶段，体内特异性IgE含量升高在致敏阶段发挥着重要作用，而肥大细胞脱颗粒在发敏阶段发挥着重要作用。其发病机制是因为抗原进入机体以后，刺激B细胞转化为浆细胞产生IgE抗体，其与嗜碱性粒细胞或肥大细胞表面的IgE受体结合后，机体处于致敏状态。当机体再次接触到致敏原时，便与吸附在靶细胞膜表面的IgE抗体结合，引起靶细胞发生一系列酶反应，导致过敏介质的释放、血管通透性增加以及毛细血管扩张等反应，最终出现机体过敏症状。T辅助淋巴细胞（Th细胞）分泌的细胞因子对I型变态反应中IgE抗体的合成起着重要的调节作用。Th细胞根据自身所分泌的细胞因子，主要分为Th1和Th2两个亚群。Th1细胞分泌的细胞因子包括IL-2、IFN-γ、TNF-β等，主要参与细胞免疫应答过程；Th2细胞分泌的细胞因子包括IL-4、IL-10等，主要参与体液免疫应答过程。白介素-4（IL-4）作为B细胞的旁分泌生长因子，可刺激B细胞，促进IgE抗体的合成；而干扰素γ（IFN-γ）可抑制细胞合成IL-4。在一定程度上抑制IgE的产生是从根本上预防I型变态反应性疾病发生的关键所在，而细胞因子IL-4和IFN-γ比例的失衡是导致IgE分泌异常的重要原因之一。因此，调节细胞因子IL-4和IFN-γ的分泌及比例，可起到抗I型变态反应的作用［3-5］。

目前临床治疗I型变态反应性疾病多采用激素类药物和抗组胺类药物，控制过敏症状的发生，所以通常疗效短暂且易反复发作。而薯蓣丸治疗的特色便在于可标本兼治，具有抗过敏和调节免疫的作用［6］。遵循《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治第六》“虚劳诸不足，风气百疾，薯蓣丸主之”，其主治虚劳诸不足，抗病力薄弱，被外邪侵袭所致的虚损兼夹外邪之证，认为“风气百疾”均在薯蓣丸的治疗范围以内。药理研究证实其可调节细胞免疫与体液免疫功能，提高机体免疫力［7］，刺激红细胞、白细胞生成［8］。薯蓣丸方中所含多种药物经药理研究证实有改善免疫功能的作用，如薯蓣可直接作用于小鼠免疫反应早期阶段，使全身淋巴器官的发育和机体免疫力加强，能增强机体的细胞免疫功能和体液免疫功能，对机体免疫力有改善作用；所含四君子汤能促进T细胞分泌集落刺激因子，提高机体免疫功能［9］；所含四物汤可促进ConA诱导的淋巴细胞增殖，增加T细胞功能，具有免疫激活作用，对体液免疫和细胞免疫也均有显著增强作用［10-12］，使HSP70及其抗体表达更进一步加强，抵抗应激免疫抑制［13-14］。因此，可以从一个方面证实薯蓣丸确实能提高机体抵抗力，抵御风邪的侵袭，减少疾病的发作。

研究结果表明，薯蓣丸可抑制大鼠同种被动皮肤过敏反应，使致敏处皮肤毛细血管通透性降低，吸光度值下降。薯蓣丸对抗体介导的大鼠肥大细胞脱颗粒具有抑制作用，并能够使致敏大鼠血清中细胞因子IL-4含量减少、IFN-γ含量增加、IFN-γ/IL-4比值升高、IgE抗体的含量减少。实验结果还表明薯蓣丸低、中、高剂量的量效关系明显，且高剂量效果良好。

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Objective：To study the effect and the mechanism of Shuyu Pills on anti type I allergic reaction. Method: Taking ovalbumin as allergen to prepare type I allergic reaction rat models and to prepare anti- ovalbumin antiserum containing IgE， we adoptedpassive cutaneous anaphylaxis （PCA）reactionexperimental method to observe and detect the diameters， the optical density （OD） and the inhibition rate of the locus coeruleus in each group， applied pericranium mast cell in model rats sensitized by anti- ovalbumin serum to observe the effect on mast cell degranulation and used Elisa method to detect the effect on the changes of content of IL-4， IFN-γ and IgE in serum of type I allergic reaction model rats. Result: Shuyu Honey Pills could significantly inhibit homologous PCA reaction and decrease the content of IL-4 and IgE in serum of type I allergic reaction model rats. Conclusion: Shuyu Honey Pills have the effect of anti type I allergic reaction. The possible mechanism is that Shuyu Honey Pills could regulate Th1/Th2 cytokine level through improving the secretion of IFN-γ and decreasing the content of IL-4 and IgE.

Shuyu Pills；Type I allergic reaction；IL-4；IFN-γ

R285.6

B

1004-2814（2016）09-0852-03

2016-05-04