L-茶氨酸对产肠毒性大肠杆菌引起的免疫应激小鼠肝脏的保护作用研究

刘秋玲，龚志华，陈凌，刘遵莹，邓燕莉，陈栋，肖文军,3*



L-茶氨酸对产肠毒性大肠杆菌引起的免疫应激小鼠肝脏的保护作用研究

刘秋玲1,2，龚志华1,2，陈凌1,2，刘遵莹1,2，邓燕莉1,2，陈栋1，肖文军1,2,3*

1. 湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南长沙410128；2. 湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南长沙410128；3. 湖南农业大学湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南长沙410128

以SPF级Balb/c雌性小鼠为实验动物，对其适应性饲养3 d后连续30 d灌喂不同剂量L-茶氨酸，然后腹腔注射产肠毒性大肠杆菌E44813诱导免疫应激，5 h后取样，分析研究了各组小鼠肝脏与脾脏系数，血清谷丙转氨酶（Alanine aminotranferease, ALT）与谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase, AST）含量，肝组织匀浆丙二醛（Malondialdehyde, MDA）水平与谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-PX）、过氧化氢酶（Catalase, CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活性，肝组织病理学变化，以及血清中γ-干扰素（γ-Interferon, IFN-γ）、白细胞介素-4（Interleukin-4, IL-4）的表达量，以探明L-茶氨酸对产肠毒性大肠杆菌免疫应激小鼠肝脏的保护作用。结果表明，不同剂量的茶氨酸干预处理均能明显降低由大肠杆菌E44813感染引起的肝脏、脾脏系数的升高，降低血清ALT、AST及肝组织匀浆MDA水平，提高肝组织匀浆SOD、CAT、GSH-PX活性，减少IFN-γ、IL-4表达量，改善肝脏组织病理损伤，其中以300 mg·kg-1剂量组效果最好，说明茶氨酸干预对产肠毒性大肠杆菌诱导的免疫应激小鼠肝损伤具有保护作用，而且可能是通过减少IFN-γ与IL-4的表达、降低炎症反应、提高抗氧化能力等途径达到保护肝脏的作用。

L-茶氨酸；产肠毒性大肠杆菌E44813；免疫应激；肝脏保护

大肠埃希菌（），俗称大肠杆菌，存在于人和动物肠道，属正常菌丛。当宿主免疫力下降或大肠杆菌侵入肠外组织时，可引起肠外感染。产肠毒性大肠杆菌（ETEC），是发展中国家婴幼儿及旅游者腹泻的主要病原菌，由食入被污染的食物或水而感染，主要居留于小肠近端，产生肠毒素而致病，也可引起家畜和动物大肠杆菌病（Colibacillosis）或腹泻[1]。全球每年因ETEC感染的病例高达6.5亿人次以上，导致30万至50余万5岁以下儿童死亡[2-3]。ETEC引起的动物疾病同样严重影响全球畜牧业生产和发展[4]。多年来，复合抗生素的使用在一定程度上能够治疗大肠杆菌感染引起的疾病，同时也导致多种耐药性ETEC菌株不断产生并迅速传播扩散，造成抗生素低效并在动物体内的蓄积，引发机体抵抗力下降，易继发或并发多种疾病，因此毒副作用小、不易产生耐药性的生物活性物质的开发利用是未来预防和防治大肠杆菌感染的重要趋势。

L-茶氨酸是茶叶中特征性游离氨基酸，具有增强抗肿瘤药物药效[5-8]、增强记忆[9]、抗衰老[10]、缓解抑郁[11-12]、保护心脑血管[13-14]、抗疲劳[15]、降压安神[16]等多种生物活性，已被人们广泛认可。肝脏是机体物质与能量代谢的重要器官，同时也是重要的免疫器官，在抵抗细菌感染方面具有重要作用，有研究表明L-茶氨酸对酒精性肝损伤具有一定的保护作用[17]，但对免疫性肝损伤的保护作用未见文献报道。本研究以SPF级Balb/c雌性小鼠为实验动物，采用L-茶氨酸预防干预，再腹腔注射产肠毒性大肠杆菌E44813，研究L-茶氨酸对产肠毒性大肠杆菌免疫应激小鼠肝脏的保护作用，为Ｌ-茶氨酸的深层开发利用及临床大肠杆菌感染病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

1.1.1材料

L-茶氨酸：纯度≥98%，购于德国sigma试剂公司。

产肠毒性大肠杆菌E44813菌种：由国家植物功能成分利用工程技术研究中心保存。

1.1.2试剂

干扰素-γ（IFN-γ）ELISA试剂盒、白细胞介素4（IL-4）ELISA试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司。

天门冬氨酸转移酶（AST）、丙氨酸转移酶（ALT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.1.3仪器设备

多功能酶标仪（赛默飞世尔上海仪器有限公司），MIKRO22R 型台式冷冻离心机（德国 Hettich 公司），紫外分光光度计UV-2550（日本岛津公司），压力蒸汽灭菌锅（上海中安医疗器械厂），电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1动物实验设计

SPF级Balb/c雌性小鼠，每只小鼠体质量（21±2）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲料亦购于该公司，饲养条件为：环境温度20~25℃，相对湿度50%~70%，12 h光照。小鼠购回后于动物房适应性饲养3 d，期间自由饮水进食。

小鼠适应性喂养结束后，随机分成6组，即正常对照组、免疫应激模型组、地塞米松给药组（5 mg·kg-1），以及L-茶氨酸低（100 mg·kg-1）、中（300 mg·kg-1）、高（500 mg·kg-1）剂量组，每组10只。L-茶氨酸和地塞米松用生理盐水配制成相应浓度，空白对照组和模型组灌喂等量生理盐水，各组小鼠于每日定时接受灌喂，灌喂量为每只0.3 mL，连续灌喂30 d。最后一次灌喂结束后禁食12 h，除空白对照组以外，其余各组小鼠腹腔注射大肠杆菌E44813（0.6×108cfu·mL-1）0.02 mL·g-1，5 h后摘眼球取血，并解剖取肝脏、脾脏。

1.2.2脏器指数测定

将肝脏、脾脏于4℃生理盐水洗净血渍，滤纸吸干表面水分后称重。

计算方法：肝脏（脾脏）指数=肝脏（脾脏）质量/小鼠体质量×100%

1.2.3肝组织病理学观察

剪取肝脏右叶同一部位经10%甲醛固定24 h，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察肝组织病理改变。

1.2.4血清ALT、AST、IFN-γ、IL-4测定

各组小鼠摘眼球取血，在冰上静置2 h，3 000 r·min-14℃离心10 min，取上清液，严格按试剂盒说明书步骤操作检测血清ALT、AST水平。同时严格按ELISA试剂盒说明书检测IFN-γ、IL-4表达量。

1.2.5肝组织匀浆MDA、SOD、GSH-Px、CAT的测定

取冻存组织，液氮研磨，加预冷生理盐水制备10%的肝匀浆，严格按试剂盒说明书步骤操作检测肝脏MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平。

1.3 数据统计

采用SPSS20.0统计软件进行数据方差分析，各组间采用最小显著差数法（LSD）检验，统计结果以均数±标准差（）表示，<0.05表明有显著性差异，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 小鼠体征观察结果

产肠毒性大肠杆菌E44813腹腔注射小鼠后，各组小鼠生理状况表现出一定的差异，ETEC模型组小鼠表现为弓背、皮毛蓬松易脱落，呼吸缓慢，行动迟缓，精神萎靡，嗜睡，大便稀稠带白色粘液及血迹；而L-茶氨酸各剂量组及地塞米松组小鼠亦出现上述症状及体征，但均有所减轻，且以300 mg·kg-1L-茶氨酸剂量组上述症状最轻。

2.2 L-茶氨酸对免疫应激模型小鼠肝脏、脾脏指数的影响

L-茶氨酸对试验各组小鼠肝脏、脾脏指数的影响结果见表1。从表中可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠肝脏、脾脏指数显著升高（<0.01）；L-茶氨酸各剂量处理组和地塞米松组均能显著降低大肠杆菌E44813引起的肝脏、脾脏指数升高（<0.05或<0.01）。

表1 L-茶氨酸对各组小鼠肝脏、脾脏指数的影响（n=10）

注：与正常组比较，##：<0.01；与模型组比较，*：<0.05，**：<0.01。下同。

Note: Compared with normal group, ##:<0.01. Compared with model group: *:<0.05, **:<0.01. The same below.

2.3 L-茶氨酸对免疫应激模型小鼠肝脏病理的影响

经HE染色，在光学显微镜下观察肝组织的病变情况，结果如图1所示。正常组小鼠肝组织肝小叶结构清晰，肝索排列整齐，以中央静脉为中心向四周呈放射状，核膜清晰核仁明显；模型组肝组织损伤严重，肝小叶结构破坏，小叶内有大量空泡状病变，伴中性粒细胞单核细胞等炎症细胞浸润；地塞米松组和L-茶氨酸各剂量组仅有少量炎症细胞浸润及小空泡，说明其均能减轻大肠杆菌引起的肝脏组织病变范围与程度。

注：a：正常组；b：模型组；c：茶氨酸低剂量组；d：茶氨酸中剂量组；e：茶氨酸高剂量组；f：地塞米松组。

2.4 L-茶氨酸对免疫应激模型小鼠血清ALT、AST的影响

ALT、AST是目前临床上常用的肝细胞损伤生化指标，当肝脏发生损伤时血清中ALT、AST显著升高。由表2可知，与正常对照组比较，模型组小鼠血清ALT、AST含量显著升高（<0.01），表明产肠毒性大肠杆菌感染严重损伤肝脏；茶氨酸各剂量组和地塞米松组均能明显降低产肠毒性大肠杆菌E44813引起的小鼠血清ALT、AST的升高（<0.01），减轻肝损伤，其中以L-茶氨酸中剂量组效果最佳。

表2 L-茶氨酸对各组小鼠血清ALT、AST的影响（n=10）

2.5 L-茶氨酸对免疫应激模型小鼠血清IFN-γ、IL-4表达量的影响

由表3可以看出，与正常对照组比较，模型组小鼠血清促炎因子IFN-γ和抗炎因子IL-4表达显著升高（<0.01），说明炎症反应剧烈；L-茶氨酸各剂量组和地塞米松组均能显著降低产肠毒性大肠杆菌E44813引起的小鼠血清IFN-γ、IL-4升高（<0.01），减轻炎症反应，其中以L-茶氨酸中剂量组效果最佳。

表3 L-茶氨酸对各组小鼠血清IFN-γ、IL-4的影响（n=10）

2.6 L-茶氨酸对免疫应激模型小鼠肝组织匀浆MDA、SOD、GSH-Px、CAT的影响

MDA为脂质过氧化产物，间接反映细胞损伤程度。图2显示，与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织匀浆MDA显著升高，SOD、GSH-Px、CAT活性显著降低（<0.01）；与模型组相比，L-茶氨酸各剂量组和地塞米松组MDA显著降低（<0.01），SOD、CAT活性显著升高（<0.01）；与模型组比较，L-茶氨酸低、中剂量组GSH-Px显著升高（<0.01），L-茶氨酸高剂量组和地塞米松组与模型组比较GSH-Px差异不显著，无统计学意义。

3 讨论

肝脏作为机体重要的免疫器官，含有丰富的kupffer细胞，正常情况下可以清除通过门静脉进入肝脏的微生物、内毒素、异种抗原和免疫复合物等大分子物质，从而起到抵御细菌感染的作用[18]。当机体受到严重创伤、烧伤、感染时，肠黏膜通透性增高，导致细菌及细菌产物易位，由肠腔进入门静脉血流，大量细菌感染造成肝脏kupffer细胞的过度激活，一方面释放大量细胞因子、炎症介质，产生炎症级联反应，诱导肝损伤；另一方面生成大量氧自由基，脂质过氧化物堆积，抗氧化酶活性降低，进一步使肝损伤加剧，造成肝脏功能衰退，一旦肝脏遭受损伤，机体整个免疫系统紊乱，细菌迅速传播全身，进一步引发多器官衰竭，甚至死亡[19-20]。因此，提高肝脏免疫力，减轻肝损伤，防止细菌蔓延是防治大肠杆菌感染的关键。

本研究以产肠毒性大肠杆菌E44813腹腔注射小鼠，注射后各组小鼠生理状况表现出一定的差异，模型组小鼠表现为弓背、皮毛蓬松易脱落，呼吸缓慢，行动迟缓，嗜睡，大便稀稠带白色粘液及血迹，肝脏病理切片可见出血，肝小叶结构破坏，小叶内大量空泡状病变，伴中性粒细胞单核细胞等炎症细胞浸润等病变，肝脏、脾脏指数显著升高，小鼠血清ALT、AST、IFN-γ、IL-4及肝组织匀浆MDA显著升高，SOD、CAT、GSH-Px活性显著降低，说明产肠毒性大肠杆菌感染造成小鼠肝脏抗氧化能力下降，炎症反应剧烈，严重损伤肝脏。L-茶氨酸低、中剂量组及地塞米松给药组显著降低了大肠杆菌诱导的ALT、AST、MDA、IFN-γ、IL-4的升高，升高SOD、CAT活性，其中以300 mg·kg-1剂量的L-茶氨酸效果最好，说明L-茶氨酸对免疫应激小鼠肝脏保护作用与减轻体内炎症反应、增强肝脏抗氧化能力、减少自由基生成、减轻氧化应激损伤密切相关。

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Study on the Protective Effect of L-Theanine on the Liver of Mice with Immune Stress Induced by ETEC

LIU Qiuling1,2, GONG Zhihua1,2, CHENG Ling1,2, LIU Zunying1,2, DENG Yanli1,2, CHEN Dong1, XIAO Wenjun1,2,3*

1. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Hunan Collaborative Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

SPF grade Balb/c female mice were used for this experiment. After adaptive feeding for 3 d, the mice were pre-treated orally with different dosages of L-theanine once daily for 30 d. ETEC E44813 intraperitoneal injection was subsequently performed and samples were collected 5h later. The coefficient of liver and spleen, levels of serum alanine aminotranferease (ALT), aspartate aminotransferase (AST) as well as liver homogenate malondialdehyde (MDA), and activities of liver homogenate superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase(GSH-Px), pathological changes of liver, expressions of serum γ-Interferon (IFN-γ) and Interleukin-4 (IL-4) were studied to explore the protective effects of L-theanine on liver of ETEC immune mouse model. Results show that pretreatment with L-theanine significantly reduced the increase of liver and spleen coefficient caused by ETEC infection, lowered the levels of serum ALT, AST and liver homogenate MDA, increased the activities ofliver homogenate SOD, CAT, GSH-Px, decreased the expressions of serum IFN-γ, IL-4, and improved pathological injury of liver tissue. Therefore, it can be concluded that L-theanine is able to prevent ETEC-induced hepatic injury through depressing IFN-γ, IL-4 and inflammatory reaction and enhancing hepatocyte antioxidant abilities.

L-theanine, enterotoxigenicE44813, immune stress, liver protection

Q51；Q939.1

A

1000-369X（2016）05-484-07

2016-01-20

2016-03-21

国家“十二五”科技支撑计划项目（2011BAD10B00）

刘秋玲，女，硕士研究生，主要从事茶叶功能成分利用研究。

xiaowenjun88@sina.com