茶多糖对阿霉素抑制肺癌A549细胞增殖作用的影响

魏楠，朱强强,3，陈际名,3，李彤,3，李亦凡，黄业伟,3，马啸*，王宣军，盛军



茶多糖对阿霉素抑制肺癌A549细胞增殖作用的影响

魏楠1,2，朱强强1,2,3，陈际名1,2,3，李彤1,2,3，李亦凡1,2，黄业伟1,2,3，马啸1,2*，王宣军1,2，盛军1,2

1. 云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室，云南昆明650201；2. 云南农业大学龙润普洱茶学院云南省茶深加工工程技术研究中心，云南昆明650201；3. 云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201

肺癌是全世界目前发病率和死亡率最高的癌症之一，当前治疗恶性肿瘤的主要手段之一是化疗，阿霉素是临床常用的化疗药物，然而该药物毒性较大，长期使用可发生剂量依赖性的不可逆的心肌病变、骨髓抑制等，同时其多药耐药性的存在也使它在临床应用受到一定限制。为了减少阿霉素的毒副作用，通过体外培养人肺癌A549细胞，将茶叶提取物茶多糖与阿霉素联用，加入A549细胞，24 h后以噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率。结果表明，当阿霉素质量浓度为3 mg·L-1时，对肺癌A549细胞的抑制效果最明显；不同浓度茶多糖与1、2、3 mg·L-1阿霉素联用，以2 mg·L-1阿霉素与6 mg·L-1茶多糖联用时对肺癌A549细胞的抑制效果最明显，且优于单独使用3 mg·L-1阿霉素的效果。阿霉素可诱导A549细胞凋亡，茶多糖与阿霉素联用可减少阿霉素的使用剂量，增强阿霉素对肺癌A549细胞的增殖抑制作用。

茶多糖；阿霉素；抗肿瘤

目前化疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，在肿瘤根治性治疗、辅助治疗、姑息治疗中发挥重要作用。而常用的化疗药物阿霉素（DOX）属于高效广谱抗癌药物，在临床应用时，主要通过插入细胞DNA，引发拓扑异构酶Ⅱ破坏DNA的三级结构来发挥药效[1]。迄今为止，阿霉素单独或与其他抗肿瘤药物联合用药，均被认为是治疗实体肿瘤，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等的一种强有力的化疗药物[2]。但阿霉素对心脏、肾脏及神经等正常组织细胞有较严重的毒副作用，加之用药量大，且能到达病灶部位发挥抗肿瘤的比例很低，降低了生物利用度；此外，还有一些肿瘤细胞会对药物失去敏感性等，这些缺陷严重限制了阿霉素临床药效的发挥[3-4]。

糖类是自然界最丰富的有机化合物，也是重要的生物高分子化合物，多糖及其复合物分布广泛，具有多种多样的生物学功能[5-6]。茶叶多糖（TPS）是从茶叶中提取出来的具有多种生物活性且结构复杂的杂多糖或其复合物。近年来文献报道了茶叶具有广泛的药理和营养价值，其生物活性与茶叶中所含的活性成分密切相关。茶多酚、茶色素、咖啡碱等生理活性成分已研究较多，而茶叶多糖的研究则相对较少，随着对多糖研究的日益深入，发现茶叶多糖在抗肿瘤方面有一定效果[7-9]。因此，本研究旨在探讨茶多糖与抗癌药物阿霉素联用对肺癌细胞A549的增殖抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

阿霉素购自玛雅试剂有限公司；人肺癌细胞系A549取自实验室液氮冻存；DMEM 高糖培养基、牛血清购自Hyclone公司；吖啶橙、噻唑蓝（MTT）购自Genview公司；DMSO购自上海浩然生物技术有限公司。DAPI染液购自上海麦约尔生物技术有限公司；RIPA细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；Reagent A/B 购自天根生化科技有限公司；30%聚丙烯酰胺购自美国Bio-RAD公司；Anti-rabbit Ig-G、Anti-mouse Ig-G购自R&D Systems China；Magic-Marker购自Invitrogen公司；Prestained Protein Larder购自Thermo公司；0.5M Tris-Hcl Buffer pH-6.8、1.5 mol·L-1Tris-Hcl Buffer pH-8.8购自Bio-RAD公司；TEMED购自Sigma公司；BCA试剂购自Beyotim公司；PVDF膜购自Millpore公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、TRIS购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 茶多糖提取

茶多糖提取采用热水浸提、乙醇沉淀法。提取温度70~80℃，提取时间1 h，重复提取3次，料液比为1:10。醇沉时乙醇浓度（体积分数）为80%。加水冻干10次，在此条件下，将50 g茶叶进行提取，获得茶多糖14.48 g。

1.2.2 细胞培养

A549细胞复苏后培养于37℃ 5%二氧化碳的培养箱中，使用加入10%血清和1%青链霉素的DMEM高糖培养基。每日观察细胞生长情况，待细胞铺满整个培养皿底部80%后，进行细胞传代。

1.2.3 MTT测细胞存活率

使用96孔板将A549细胞分为12组，每组8个平行，每孔细胞接种量为5×105个，分别为空白、对照、阿霉素组，阿霉素实验组处理梯度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg·L-1；阿霉素与茶多糖联用组为1、2、3 mg·L-1的阿霉素与茶多糖联用，茶多糖质量浓度梯度为1、2、3、4、5、6、7、8 mg·L-1，避光培养24 h后，吸走上清，PBS洗1次，加入MTT，避光处理4 h，弃去上清，每孔加入150 μL DMSO，待紫色结晶完全溶解，使用酶标仪在波长492 nm处测量吸光值，计算存活率。

存活率=（实验组-空白组）/（对照组-空白组）×100%

1.2.4 DAPI荧光染色观察细胞凋亡

通过MTT测细胞存活率的实验筛选出肺癌A549细胞存活率最低的联用浓度，按照分组将细胞以每孔5×105个的数目接种于事先放置爬片的12孔板上进行培养，待细胞贴壁生长后进行药物处理30 min，多聚甲醛固定20 min，将爬片放置在滴有DAPI染液的载玻片上静置20 min，然后在荧光显微镜下进行观察拍照。

1.2.5 免疫蛋白印迹

通过MTT测细胞存活率的实验筛选出肺癌A549细胞存活率最低的联用浓度，将细胞以每板5×106个的数目接种于100 mm培养皿，待细胞贴壁生长后，加入药物处理半小时，弃去上清，每板加入300 μL裂解液（RIPA裂解液∶PMSF为100∶1）放入冰盒处理半小时，刮下培养皿上的蛋白，4℃，1 500 r·min-1离心10 min，取上清进行BCA蛋白定量，根据定量结果进行制样，离心，95℃加热10 min。将样品逐一加入事先配制好的胶板，50 V，30 min；120 V，70 min，转膜1 h，5% BSA封闭1 h，加一抗4℃过夜，然后用1xPBST洗膜3次，加二抗常温孵育1 h，1xPBST洗膜3次，曝光。

1.3 统计分析

实验数据采用SPSS17.0软件进行分析，采用单因素方差分析（oneway ANOVA）进行均值比较，<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同剂量阿霉素诱导的A549细胞存活率

以质量浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg·L-1的阿霉素处理A549细胞，之后以MTT检测细胞存活率，结果显示，当阿霉素质量浓度为3 mg·L-1时，A549细胞的存活率最低（<0.01）（图1）。

2.2 阿霉素与茶多糖联用对A549细胞存活率的影响

以3 mg·L-1阿霉素与不同浓度茶多糖联用处理A549细胞，发现细胞存活率都有所下降（图2-A）。为了减少阿霉素的毒副作用，试验将阿霉素的质量浓度降低到2 mg·L-1、1 mg·L-1与茶多糖联用，当阿霉素质量浓度为2 mg·L-1时，发现6 mg·L-1茶多糖与阿霉素联用对肺癌A549细胞的抑制效果最明显（图2-B）；当阿霉素质量浓度为1 mg·L-1时，1 mg·L-1和3 mg·L-1茶多糖与阿霉素联用对肺癌A549细胞的抑制效果最优（图2-C）。为了筛选出最佳的联用浓度，使得阿霉素的毒副作用及A549细胞的存活率较低，试验将对细胞抑制效果明显的联用浓度作了对比实验，结果如图2-D所示。从图中可以看出，当阿霉素质量浓度为2 mg·L-1，茶多糖质量浓度为6 mg·L-1时，二者联用对肺癌A549细胞的抑制效果明显优于其他联用浓度（<0.001）。因此认为适当的浓度的茶多糖与阿霉素联用，可以增强阿霉素对肺癌A549细胞的抑制作用。

注：A：3 mg·L-1阿霉素与茶多糖联用；B：2 mg·L-1阿霉素与茶多糖联用；C：1 mg·L-1阿霉素与茶多糖联用；D：最优联用浓度筛选。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。

2.3 茶多糖与阿霉素联用细胞凋亡的观察

通过DAPI荧光染色可以看出，空白对照组几乎没有凋亡细胞，2 mg·L-1阿霉素、3 mg·L-1阿霉素、6 mg·L-1茶多糖、6 mg·L-1茶多糖与2 mg·L-1阿霉素联用5个实验组中均发现凋亡细胞，其中以6 mg·L-1茶多糖与2 mg·L-1阿霉素联用实验组凋亡细胞率较高（图3）。

2.4 茶多糖与阿霉素联用对促凋亡蛋白表达的调节

为进一步研究茶多糖与阿霉素联用对肺癌A549细胞的作用机制，试验采用Western blot观察相关促凋亡蛋白的表达量。结果显示，与对照组相比，2 mg·L-1阿霉素、3 mg·L-1阿霉素、6 mg·L-1茶多糖及6 mg·L-1茶多糖与2 mg·L-1阿霉素联用都能够引起BAX、p53、Caspase-3蛋白的表达上调；而相较于2 mg·L-1阿霉素、3 mg·L-1阿霉素、6 mg·L-1茶多糖来看，6 mg·L-1茶多糖与2 mg·L-1阿霉素联用时BAX、抑癌基因p53编码的蛋白（p53）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）蛋白表达上调明显增加（图4-A）。对Western blot的结果进行蛋白定量（即各蛋白与⍺-Tubulin的比值，用来校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性）柱形图结果（图4-B）与Western blot结果相一致。

3 小结与讨论

茶多糖和阿霉素联用，能够使具有毒副作用的阿霉素在减少用量的同时不改变对肺癌A549细胞的增殖抑制作用，或许是茶多糖中含有的蛋白和氨基酸与阿霉素反应改变了其原本的结构，从而增加了阿霉素的敏感性[10-11]，但并未得到实验的证实。因此，为了更有效地发挥阿霉素的药理和药效作用，减少毒副作用，为阿霉素的合理使用提供充分的实验依据和理论支持，笔者研究了茶多糖与阿霉素联用对肺癌A549细胞体外增殖的抑制作用，实验中采用MTT法检测了单独使用阿霉素对肺癌A549细胞增殖的抑制情况。结果显示不同浓度阿霉素对肺癌A549细胞抑制情况有所不同，3 mg·L-1阿霉素组对肺癌A549细胞的增殖抑制作用明显高于其他浓度。这一结果是否表明不同浓度阿霉素对细胞增殖抑制作用的不同与小剂量化疗引起细胞凋亡，大剂量化疗则导致细胞坏死[12]的情况有关尚需进一步研究。而通过Western blot实验及各蛋白与α-Tubulin比值柱状图可以发现，茶多糖与阿霉素联用组中BAX、Caspase-3及p53蛋白的表达量与单独使用3 mg·L-1阿霉素组基本相同，这也进一步证实了MTT实验的结果，证明了联用的相关凋亡机制，但具体作用的相关靶点尚不清楚，需进一步深入研究。

本实验中采用MTT法检测肺癌A549细胞的存活率，因每次细胞接种量的细微差别，以及每次实验中对细胞处理时的客观因素，同一浓度的阿霉素对细胞的杀伤效果会有细微的差别。实验中采用的茶多糖并非提纯后的茶多糖，而是水提醇沉所取得的粗茶多糖，因此并不能确定纯度较高的茶多糖是否具有本实验中增加阿霉素对肺癌A549细胞杀伤的效果。在SDS-page中出现的差异蛋白并非只有本实验中经过Western bolt确定的3种凋亡蛋白，因时间和客观环境的影响，并未对其余蛋白进行探索确定。同时在Western bolt实验结果中，发现单独使用6 mg·L-1茶多糖组BAX蛋白含量表达与茶多糖和阿霉素联用组相比差异较为明显（<0.01），而Caspase-3及p53蛋白差异与BAX蛋白相比，差异略微较小（<0.05），猜测可能是与相关凋亡通路有关，期望在后续实验中对此进行探索，并对本实验中所存在的问题进一步完善和优化。

参考文献

[1] 许红, 王开贞, 王玉奎. 临床常用药物[M]. 济南: 山东科学技术出版社, 2005: 317.

[2] Bisht S, Maitra A. Dextran-doxorubicin chitosan nanoparticles for solid tumor therapy [J]. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol, 2009, 1(4): 415-425.

[3] Batrakova EV, Li S, Brynskikh AM, et al. Effects of pluronic and doxorubicin on drug uptake, cellular metabolism, apoptosis and tumor inhibition in animal models of MDR cancers [J]. J Control Release, 2010, 143(3): 290-301.

[4] Feridooni T, Hotchkiss A, Remley-Carr S, et al, Cardiomyocyte specific ablation of p53 is not sufficient to block doxorubicin induced cardiac fibrosis and associated cytoskeletal change [J]. PLoS One, 2011, 6(7): e22801.

[5] Ajit Varki, Richard Cummings, Jeffrey Esko. Essentials of Glycobiology [M]. 北京: 清华大学出版社, 2002: 35-36.

[6] 周鹏, 谢明勇, 傅博强. 多糖的结构研究[J]. 南昌大学学报: 理科版, 2001, 25(2): 197-204.

[7] Jeremy M Berg, John L Tymoczko, Lubert Stryer, et al. Biochemistry [M]. W. H. Freeman & Co (sd), 2011: 2538.

[8] 严鸿德, 汪东风, 王泽农, 等. 茶叶深加工技术[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1998: 24-26.

[9] Richard Béliveau, Denis Gingras. Green tea: prevention and treatment of cancer by nutraceuticals [J]. The Lancet, 2004, 364: 1021-1022.

[10] Marcel W L, Koo Chi H. Pharmacological of green tea on the gastrointestinal system [J]. European Journal of Pharmacology, 2004, 500: 177-185.

[11] Laura Bravo. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutrition significance [J]. Nutr Rev, 1998, 56(11): 317-333.

[12] Wang SB, Yang CZ. Research advance in apoptosis induced by chemotherapy [J]. Chinese Journal of cancer, 2000, 19(12): 1173-1176.

Tea Polysaccharide Increased Doxorubicin Inhibition of Lung Cancer A549 Cells

WEI Nan1,2, ZHU Qiangqiang1,2,3, CHEN Jiming1,2,3, LI Tong1,2,3, LI Yifan1,2, HUANG Yewei1,2,3MA Xiao1,2*, WANG Xuanjun1,2, SHENG Jun1,2

1. Key Laboratory of Puer Tea Science, Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Longrun Pu-erh Tea Academy, Yunnan Research Center for Advanced Tea Processing; Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 3. College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

Lung cancer has high incidence and mortality rates around the world and chemotherapy is widely applied in cancer treatment. Doxorubicin (DOX) is a kind of chemotherapy drug which commonly used in clinical trials. However, the drug has many side effects and may cause a dose-dependent injury in the long term. These side effects include irreversible cardiopulmonary, bone marrow suppression and so on. Moreover, its mufti-drug resistance also restricts it in certain clinical application. The effect of polysaccharides of tea extract combined with doxorubicin onhuman lung cancer cell line A549 were tested in this study. A549 was first culturedwith different concentrations of DOX. After 24h culture, apotheosis ratio was determined by MTT. The results show that the DOX dose for the best inhibiting effect was 3 mg·L-1according to MTT detection. Three doses of DOX were selected to combine tea polysaccharide and suppress A549 cell survival. The combination of 2 mg·L-1DOX and 6 mg·L-1tea polysaccharide had been demonstrated to have better suppressing efficiency than 3mg·L-1DOX alone. DOX could efficiently suppress A549 cell proliferation and this inhibiting effect was enhanced by combining with tea polysaccharide, which could decrease the applied dose of DOX.

tea polysaccharides, doxorubicin, antitumor

Q539；R734.2

A

1000-369X（2016）05-477-07

2016-03-15

2016-05-16

魏楠，女，硕士研究生，主要从事茶的功效研究，E-mail：fanhuayunduan@163.com。

maxiao.ynau@qq.com