β-半乳糖苷酶固定化研究

江贤君，包建波

(1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉430023，2.武汉博蓝科技发展有限公司，湖北 武汉430014)



β-半乳糖苷酶固定化研究

江贤君1，包建波2

(1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉430023，2.武汉博蓝科技发展有限公司，湖北 武汉430014)

用微孔陶瓷吸附和戊二醛交联复合法制备了固定化β-半乳糖苷酶。试验结果表明：用3mm微孔陶瓷吸附，以2.0%戊二醛，时间1.5 h，温度25 ℃交联后，获得固定化酶活为146 U/g，固定化酶活力回收率为60.8%。固定化酶最适温度为50 ℃，最适pH=7。固定化酶的km=5.6 mmol/L。半衰期为33d。

微孔陶瓷；固定化；β-半乳糖苷酶

1　引言

β-半乳糖苷酶亦称乳糖酶，广泛用于乳制品工业，生产中以游离酶形式水解乳糖生产低乳糖牛奶以缓解乳糖不耐症[1]。乳糖酶来源于微生物合成，分泌量小，提取成本高，导致乳糖酶价格高，因此很多科技工作者进行了大量研究寻找合适方法将乳糖酶固定化以降低生产成本。文献报道固定化方法有[2～8]明胶包埋固定法，树脂吸附交联固定法，有机试剂交联法，壳聚糖吸附交联固定法以及磁性微球固定法等。考虑到工业生产对固定化酶诸多要求，本研究以微孔陶瓷为固定化酶支撑载体，再用戊二醛交联形成固定化酶，制得的固定化酶酶活回收高，最适温度提高，半衰期延长，具有生产实用价值。

2　材料与方法

2.1材料与试剂

β-D-半乳糖苷酶(哈尔滨美华生物技术股份有限公司,比活力>3 000 IU/g,温度39 ℃，pH6.8,溶液中25 ℃半衰期8d)；微孔陶瓷(广东佛山陶瓷研究所，粒径3 mm,孔容>46%，蛋白吸附专用)；其它试剂为市售(分析纯)。

2.2主要仪器

实验室玻璃填充柱：φ2×25 cm；

WFJ7200型可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)；

工件的加工表面质量直接影响到产品的使役性能，在实际生产中必须加以严格控制，如发动机零件的表面层烧伤会引起使用寿命大幅度下降。目前，工程中常用的烧伤评价方法主要有：目测法、酸洗法、表面显微硬度法等，均属于定性评价方法，且后两者属于破坏性方法。图18为高温合金典型的表面烧伤图像，从图18(a)到图18(e)烧伤程度依次变得严重。

电子天平，pH仪，集热式恒温加热磁力搅拌器，水浴锅等。

2.3试验方法

综合新零售城市创新各分项指数来看，当前成都市新零售的领先之处在于：拥有全国领先的品牌数字化智慧门店数量、物流网点数量，同时在进口高端商品的消费上也拥有一定领先势能。作为一个美食之都，成都外卖已经渗透在各个领域，品类多、味道好、客单价高的趋势显现。成都打造的“10分钟经济圈”，让其成为国内便利店数量最多的城市之一。未来，成都人三公里范围将有专属理想生活圈。

2.3.1分析检测方法

2.3.1.1葡萄糖标准曲线[8]

乳糖水解后还原糖含量增加，因此在稀溶液中可用DNS法绘制葡萄糖标准曲线，并以此为依据定义酶活力和比较酶活力大小。制得葡萄糖标准曲线如图1(y = 0.953 3x, R2= 0.998 7)所示。

2.3.1.2酶活力测定[9]

用pH6.8的磷酸盐缓冲液，配制浓度为1 g/L的乳糖酶溶液。取一定量的酶加入到45 g/l乳糖溶液中，在39 ℃条件下水浴10 min。然后取1 mL的反应溶液置于100 ℃沸水中灭活10 min。将灭酶活的溶液稀释100倍后，量取0.3 mL放入15 mL的带塞子的试管中，再滴加0.4 mL的DNS，100 ℃水浴显色2 min。冷却后测量吸光度，计算酶活。定义乳糖酶的活力为：在39 ℃，pH = 6.8条件下反应10 min，每分钟使OD520增加0.000 1个单位为1个酶活力单位：

乳糖酶比活U/g=(OD1-OD0)n×10 000/(0.953 3×m×10)单位：mg/(mL*min*g)

OD1水解后乳糖液吸光度

OD0水解前乳糖吸光度

除了《合同法》上的一般规定，对于格式条款的效力问题，《合同法》第四十条还做出了特殊规定，认定提供格式条款的一方免除其责任、加重对方责任、排除对方主要权利的，该条款无效。那变更合同成立时点的格式条款是否属于前述情形呢？

2.3.3.3米氏常数的测定[10]

女子望着他，努力抬高手臂，嘴巴微微开阖，似乎是想要说些什么。他急忙俯下身子，将耳朵贴到了女子的唇边，女子却只呕出了一口血，然后便一动也不动了。

m酶量(g)

可见随戊二醛浓度增加固定化酶失活越来越严重，因为戊二醛既是交联剂也是蛋白质变性剂。

10 10 min

2.3.1.3固定化酶活力测定

参照2.3.1.2方法取一定量固定化酶加入到乳糖溶液中，并在合适温度，pH条件下测定。

2.3.2固定化酶制备方法

2.3.2.1微孔陶瓷吸附试验

配制120 U/mL乳糖酶溶液(Ph = 6.8)1L，将预处理后微孔陶瓷50 g装入φ2×25 cm玻璃填充柱，以100 mL该酶溶液反复流经玻璃柱进行吸附直至酶溶液比活不再下降为止，缓冲液清洗微孔陶瓷，干燥后冰箱保存，并测定吸附固定酶活力。

2.3.2.2戊二醛交联试验

取1g吸附后的微孔陶瓷固定化酶加入交联剂戊二醛复合固定化。分别在浓度为0.4 %、0.8 %、1.2 %、1.6 %、2 %，2.4%戊二醛溶液中进行交联试验确定合适戊二醛浓度；在0.5 h、1 h、1.5 h、2.0 h条件下交联确定合适交联时间；在20 ℃、25 ℃、30 ℃、3 5℃、40℃温度条件下交联确定合适交联温度；在此基础上确定较佳戊二醛交联条件组合。最后计算总活力回收率。

2.3.3固定化酶性质研究

2.3.3.1固定化酶合适温度

一份菜加上一碗米饭是最常见的外卖搭配。有人喜欢吃荤，就点个红烧排骨；有人喜欢吃素，常点素炒圆白菜，不管哪种菜肴，单独与主食搭配都存在营养缺陷。因此，点外卖一定要注意荤素搭配，肉类和蔬菜都要有，不喜欢吃肉可以用蛋类代替。如果一荤一素两个菜吃不完，推荐点一个半荤半素的菜，比如青椒炒肉丝、西红柿炒鸡蛋。

按2.3.1.2方法取等量酶溶液分别在25 ℃、30℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃条件下水解乳糖，比较相对活力大小；并取等量复合固定化酶分别在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃条件下水解乳糖，比较相对活力大小。

2.3.3.2固定化酶合适温度

按2.3.1.2方法分别取等量溶液酶在pH 5.5、6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5缓冲液中39 ℃水解乳糖，比较相对活力大小；再分别取等量复合固定化酶在pH 5.5、6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5缓冲液中50 ℃水解乳糖，比较相对活力大小。

n稀释倍数

在两组4个250 mL试剂瓶中用pH = 6.8缓冲液分别配制0.5,0.75,1.0,1.5 mmol/L的乳糖溶液，其中一组每瓶加入120 U游离酶，在39 ℃温度下反应30 min，测定酶活并计算反应速度。在另一组每瓶加入1g固定化酶，在最适条件下测定酶活并计算反应速度。最后由米氏方程通过双倒数作图求米氏常数km。

对照组患者给予氨氯地平阿托伐他汀钙（辉瑞制药有限公司，国药准字J20130030，规格5 mg∶10 mg/片）治疗，1次/d，1片/次，口服给药。

已知游离酶半衰期为8 d,测定固定化酶半衰期。称取10 g复合固定化酶置于100 mL pH为6.8缓冲溶液中，放置25 ℃恒温箱密封保存，分别在保存的第1,2,3,4,5 d取1 g固定化酶进行酶活力测定，然后依指数衰减定律测定固定化酶半衰期。

3　结果与分析

3.1吸附固定化酶回收率

按2.3.2.1方法比较了温度对吸附的影响，结果如图2：

图2　温度对吸附的影响

可见在室温条件下操作比较适宜。在填充柱室温操作条件下，测定微孔陶瓷固定酶平均比活为220 U/g，游离酶比活为120 U/mL：

庄昶认为邵雍以及李白、杜甫、陈师道、黄庭坚等人虽然在易、诗、文等方面有不足，但他们都是继承先贤而来，白璧微瑕。基于此种认识，庄昶将文分成不同的类别，有诗人、文人之文，有圣人之文。在《滁州志序》中，庄昶以“天下之物固有遇不遇者，盖亦数也”作喻，指出滁州不足为遇。不管是为官于此的韦应物、王元之、欧阳修，还是做客于此的苏东坡、曾巩、满执中，都是文人、诗人，他们不足以使滁州闻名，因为“骚雅余谈，文章小技者，恶足以当此哉”［3］卷六，1叶b-2叶a！他还以“月亮”为例，指出有诗人之月、文人之月、诗颠酒狂之月、自得性天之月。在他看来，前三者之“月”无足取，唯有自得性天之月，即圣贤之月才值得追求和提倡：

酶活回收率 =(50 × 固定酶比活)/(溶液酶体积 × 游离酶比活)

=(50 × 220)/(100 × 120)

=91.6%

因此采用微孔陶瓷常温下填充柱吸附操作简便，酶活回收高。

从交联试验看出戊二醛浓度与酶活呈负相关。考虑吸附洗脱影响并结合上述交联试验条件结果,再在戊二醛浓度0.4 %、0.8 %、1.2 %、1.6 %、2 %,交联时间1.5 h,室温下制备固定化酶，然后将制得的固定化酶装入填充柱，用pH = 6.8的缓冲液柱中洗脱12 h，测定酶活，结果如图6：

3.2.1戊二醛交联浓度对固定化影响

本研究试验地位于浙江绍兴县富盛镇御茶村有限公司绿茶生产地，地理位置 29°56′N，120°43′E，海拔165.7 m，坡度为18°，属于亚热带季风气候，光能资源比较丰富；年平均降水量约1400 mm，多集中在春季和夏季，年平均降水天数为125.6 d，常年相对湿度80%，属湿润地带；无霜期为200~230 d。供试的茶树品种为丰绿，种植年限为10 a，行距1.5 m。茶园基础肥力如表1所示。

让我们从就业和收入开始讨论，因为不管自由民主在哲学上有多大的吸引力，它的力量在很大程度上都得益于一个实际优势：在政治学和经济学中，自由主义的特点是分散决策，这使得自由民主国家能够胜过其他国家，并为人民带来越来越多的财富。

所有检测结果均以平均值±标准偏差（±sd，n=3）表示。数据采用Excel和SPSS 20.0对数据进行单因素分析（ANOVA）检验不同样品间的差异显著性，所有差异分析均在p=0.05水平进行。

图3　戊二醛浓度对酶活性影响

0.953 3还原糖对吸光度转换系数(葡萄糖标准曲线斜率)

3.2.2戊二醛交联时间对固定化影响

在戊二醛浓度为2.0 %，室温下在不同时间下交联，得固定化酶相对酶活大小，结果如图4：

图4　交联时间对酶活性的影响

随着交联时间增加，尤其时间>1.5 h固定化酶活性衰减严重，说明时间越长戊二醛对乳糖酶变性作用越强。

3.2.3戊二醛交联时间对固定化影响

在戊二醛浓度2.0 %，交联时间为1.5 h条件下分别在不同温度下进行交联，得固定化酶相对酶活大小，如图5：

图5　交联温度对固定化酶活的影响

可见合适交联温度为25 ℃，较高的温度导致戊二醛与酶蛋白剧烈反应从而引起酶失活。

3.2.4交联条件确定

2.3.3.4固定化酶半衰期测定[10]

3.2戊二醛交联试验结果

图6　戊二醛浓度对固定化酶洗脱影响

可见，在低浓度条件下吸附制得固定化酶长时间洗脱后固定化酶脱附明显。综合上述试验结果，确定固定化酶交联条件为室温下戊二醛浓度2.0 %，交联时间1.5 h。

主要工艺如下：①使用工装进行找中，确定机床主轴与螺孔中心重合。②残余螺栓掏空：加工螺纹孔内螺栓，直至内径为Φ149.60～Φ149.80mm时止。③螺孔内取残丝：配合使用手动工具，将存留在主螺栓孔中的螺纹丝卷出来。

3.2.5复合固定化酶总活力回收计算

以2.3.2.1法制得的活力为220 U/g微孔陶瓷固定化酶按3.2.4法交联制备50 g复合固定化酶，测得复合固定化酶活力为146 U/g,因此：

总活力回收率=吸附酶回收率×交联酶回收率

=91.6 %×(146U / 220U)

=60.8 %

对钢轨的表面状态而言，在滚筒式校直机上对钢轨进行标准校直，在较短的时间内就会出现磨耗，这是因为钢轨在校直过程中会使钢轨体内的内应力增大；在一定的压力机上对钢轨进行适量的校直，则对钢轨波磨的影响程度较轻。

3.3固定化酶性质研究

3.3.1固定化酶合适温度

在不同浓度戊二醛溶液中室温下交联1 h，得酶活相对大小如图3：

可以看出，固定化酶最适温度为50 ℃，相对于游离酶有明显飘移。固定化酶由于交联形成网状结构从而提高稳定性。50 ℃最适温度对于固定化酶连续生产防止杂菌污染非常有利。

图7　固定化酶最适温度

3.3.2固定化酶合适pH

可见，固定化酶最适pH为7.0，与游离酶最适pH 6.8差异不明显，固定化酶对pH波动略显稳定。

图8　固定化酶最适pH

3.3.3固定化酶米氏常数

根据米氏方程,采用双倒数法1/v ～ 1/s作图(v为反应速度，此即酶活性;s为乳糖浓度)结果见图9：

图9　固定化酶米氏常数

游离酶回归方程y= 0.031x+ 0.235 (R2= 0.992 5)

笔者在母猪人工授精站工作十年中经常遇到公猪发生睾丸炎，性欲缺失，精神不振，睾丸肿大、疼痛等病状。使公猪精液供精站工作无法正常开展。公猪睾丸炎是睾丸实质的炎症，由于睾丸和附睾紧密相连，容易引起附睾炎，两者常同时发生或者互相继发。根据病程和病性，临床上可分为急性与慢性、非化脓性与化脓性。

固定化酶酶回归方程y= 0.045x+ 0.252 (R2= 0.997 5)

通过回归方程可以算出游离酶km= 7.58 mmol/L，固定化酶km= 5.6 mmol/L。较游离酶固定化酶km变小，因为酶分子交联后空间构型发生一定改变导致固定化酶与底物亲和力下降。

3.3.4固定化酶半衰期

根据酶活性指数衰减定律:E=E0exp(-k*t) 可得：

酶活性半衰期t1/2= 0.693 /k

衰减常数k= ln(E/E’) / △t；

E,E’分别为前后两次测定酶活；

△t为两次测定酶活间隔时间；

按2.3.3.4方法测定酶活，以ln(E/E’) ～ △t作图，直线斜率即为k，结果如图10：

图10　固定化酶半衰期

经回归拟合分析得k= 0.021,由此得固定化酶半衰期为33 d。可见复合固定化酶半衰期明显延长。半衰期对固定化酶用于实际生产具有特别重要意义。

4　结论

将微孔陶瓷填充柱室温饱和吸附游离酶后，在戊二醛浓度2.0 %，温度25 ℃，时间1.5 h条件下交联制备得到的固定化酶比活力为146 U/g，酶活总回收率60.8 %；固定化酶km= 5.6 mmol/L,最适温度为50 ℃，半衰期为33d。本研究结果酶活回收高，半衰期长，且酶最适温度提高，另外微孔陶瓷机械强度高，为工业化固定化乳糖酶连续生产低乳糖牛奶提供了技术依据。

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Study of immobilized β-galactosidase

JIANGXian-jun1，BAOJian-bo2

(1. School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China;2. Wuhan Bo Blue Technology Company, Wuhan 430000, China)

Immobilizedβ-galactosidase has made by microporous ceramic adsorption and glutaraldehyde crosslinking. The results are as follows: aftter 3mm microporous eramic adsorption,β-galactosidase was crosslinked into immobilized enzyme by glutaraldehyde with glutaraldehyde concentration 2.0 %, temperature 25 ℃, time 1.5 hr. The activity of immobilized enzyme is 146 U/g. The recovery rate of immobilized enzyme is 60.8 %. Immobilized enzyme optimumreaction temperature is 50 ℃, the optimum pH = 7,dynamics parameter of immobilized enzyme: km = 5.6 mmol / L. The half-life period of immobilized enzyme is 33 days.

microporous ceramic; immobilized; β-galactosidase

2016-07-10.

江贤君(1962-)，男，副教授，E-mail:1098377885@qq.com.

2095-7386(2016)03-0035-04

10.3969/j.issn.2095-7386.2016.03.006

TS 252

A