小鼠视网膜剥离及铺片改良应用于电生理学的研究

李瑞萍，孙仪征，范文娟，邓锦波

河南大学生命科学学院 神经生物学研究所，河南 开封 475004



小鼠视网膜剥离及铺片改良应用于电生理学的研究

河南大学生命科学学院 神经生物学研究所，河南 开封 475004

〔目的〕 改良小鼠视网膜剥离及铺片方法，优化组织学观察及电生理学研究。〔方法〕 选用C57BL/6J小鼠在立体显微镜下进行视网膜剥离铺片，然后用免疫荧光和Dil散射标记对其效果进行评估。〔结果〕 改良后的方法能够较好地进行视网膜剥离铺片。用免疫荧光染色和Dil散射标记后，包括血管和神经细胞在内的许多组织学结构都能非常形象地观察到。〔结论〕 经过改良的视网膜铺片技术能够应用于组织学观察或电生理学研究。

视网膜剥离；铺片；免疫荧光；Dil散射标记

视网膜(retina)是位于眼球最内层的神经组织，是一层透明的、非常薄又复杂的结构。从胚胎发育来看，视网膜实际上是中枢神经系统的一部分，因其细胞类型简单、分层清楚，而被用做研究中枢神经系统功能及信息传递和调控的理想模型[1]。在各种关于视网膜的研究中，常常要用到视网膜整体剥离和铺片技术，但视网膜剥离铺片操作较繁琐、分离困难、铺片难度较大[2]，尤其在小鼠这类眼球比较小的动物中对视网膜进行剥离铺片更加困难。实践过程中，我们摸索了一种比较成熟的视网膜剥离铺片技术，为视网膜研究提供了更加方便、快捷的研究模型。

1　材料和方法

1.1实验动物

C57BL/6J仔鼠，雌雄不限，出生当日计为生后0 d(postnatal day 0，P0)。本实验选用P0～P30的小鼠作为实验动物。动物喂养在标准环境下进行，室温保持在20～26 ℃，相对湿度为55%～65%，房间内定期消毒。按照自然昼夜节律采光，自由进食和饮水。小鼠饮用水选自实验室自制的单蒸水，2～3 d更换一次垫料，并进行消毒。

1.2小鼠灌注固定

将小鼠经腹腔注射体积分数为10%的水合氯醛麻醉后开胸解剖，使心脏暴露。灌注针插入左心室，同时剪开右心房引流灌流液。先用20 mL生理盐水经心灌流固定，至肝肠变白后，再用体积分数4%的多聚甲醛20～40 mL缓慢灌流固定。可发现小鼠全身抽搐，待抽搐完全停止，小鼠身体变硬后可停止灌注。活体观察或电生理实验，可省去灌注固定。

A.倒置显微镜下完整的视网膜形态，标尺=250 μm;B.视网膜整体铺片血管分布(Collagen Ⅳ标记)，标尺=250 μm;C.视网膜小胶质细胞形态(Ibal标记)，示框内是放大的单个小胶质细胞，标尺=50 μm;D.Dil散射标记的视网膜神经细胞，标尺=25 μm图1　剥离后的视网膜及其组织学观察

1.3视网膜的剥离

用解剖剪把固定后小鼠的眼睑剪开，再用镊子将眼球取出，放在盛有0.01 mol/L的PBS的培养皿中。在立体显微镜下，双手持眼科镊，左手夹住眼球的视神经节端，右手用镊子尖在另一端扎破角膜，然后用眼科剪交叉剪开角膜，用眼科镊小心撕开相邻两瓣角膜(撕的过程中一定要小心，不要大幅度拉扯，以防视网膜破损)。可见晶状体、玻璃体、视网膜等完全暴露在视野中，用镊子将晶状体挑出，再用镊子将视网膜外围的一圈巩膜分离下来，剥离出完整的视网膜。若视网膜上粘连有色素层，也需小心地将其分离。将凹状的视网膜转移到载玻片上，用吸水纸吸去周围多余的水，用刀片在视网膜上对称地切成四瓣，呈“十”字花形，以便视网膜的展开和铺片。最后，将视网膜放在体积分数为4%的多聚甲醛EP管中，4 ℃冰箱固定2 h，待用[3]。

1.4免疫荧光标记视网膜细胞

胶原蛋白Ⅳ(collagen，Ⅳ)是由血管内皮细胞分泌的基底层的一部分，为了有效显示血管的基膜，我们采用兔抗Collagen Ⅳ多克隆抗体(1∶200，Abcam公司，ab6586)染色[4]；利用Iba1特异性地标记小胶质细胞/巨噬细胞[5]。兔抗Iba1单克隆抗体(1∶200，Abcam公司，ab108539)用于本实验。固定好的视网膜取出后，用0.01 mol/L的PBS洗3次，每次15 min。将视网膜放入 EP 管中，加入适量的一抗工作液 4 ℃孵育2～3 d。用0.01 mol/L的PBS洗3次，再加相应的二抗4 ℃避光孵育1 d。对应二抗为：Alexa568驴抗兔IgG(1∶600，Invitrog，A10042)。经0.01 mol/L的PBS洗3次后，对视网膜铺片。用毛笔小心地将视网膜平铺在干净的载玻片上，滴加质量分数为65%的DAPI甘油，加盖盖玻片，封固四周，荧光显微镜观察拍照[6]。

1.5Dil散射标记

将上述视网膜取出后用0.1 mol/L的PB洗3次，每次15 min。将视网膜放入6孔板中，每孔1～3片，放到孔中央，吸掉多余的缓冲液，使切片处于欲干未干状态。将Dil-金颗粒弹头放在基因枪内，在氦气(150～180 P.S.i.)下，将Dil-金颗粒散射到视网膜表面。在荧光立体显微镜下检查Dil标记密度，如果密度低，可以再散射一次，直到Dil密度满意为止[7]。经散射后的视网膜用0.1 mol/L的PB洗3次，最后保留在PB中，放在4 ℃，孵育12～24 h。用甘油封片，观察[8]。

2　结果

将剥离好的视网膜放在倒置显微镜下观察拍照(图1A)，可观察到视网膜的完整形态，便于继续对视网膜进行染色、研究。将视网膜整体铺片Collagen IV抗体免疫荧光后，在荧光显微镜下可观察到完整的视网膜结构(图1B)。视网膜血管形态清晰可见，毛细血管呈网状均匀分布于整个视网膜。用Iba1抗体做免疫荧光染色来检测小鼠视网膜的小胶质细胞，可以看到小胶质细胞均匀分布于整个视网膜。小胶质细胞的细胞体呈细长或椭圆，从胞体发出细长而有分支的突起(图1C)。将视网膜Dil散射标记后，可观察到Dil金颗粒均匀分散在整个视网膜上。DiI标记后的细胞有许多突起，在高倍镜下可以清楚地观察到突起的小树突棘(图1D)。

3　讨论

视网膜剥离铺片技术可以对视网膜细胞进行完整的观察研究，可用于视网膜形态学观察或电生理研究。但由于操作较繁琐、分离困难、展片难度较大、固定时间不易掌握等原因，如处理不当容易导致视网膜残缺，且组织学结构也不完整，直接影响了对实验结果的观察与分析。我们改进的视网膜剥离铺片技术避免了这些技术上的缺点, 既可观察细胞形态，也能作电生理分析。

实验中，我们选取P0～P30的小鼠作为实验动物。在幼鼠和成鼠的眼球中，存在着一些差别。幼鼠的眼球很小，环绕着整个晶状体，并与晶状体相连，所以分离时要小心，并且幼鼠视网膜很软，在固定视网膜时时间要相对长一些。成鼠的眼球相对较大，容易剥离，但是视网膜易于色素层粘连，所以，在灌注的时候要把眼球固定好，剥离时就容易分离。

本实验通过对视网膜剥离铺片操作技术的反复实验、改进和分析，总结有以下技巧：①小鼠的心脏灌流时，穿刺位置要准确，并准确剪切右心房以便灌流液顺利流出，注意剪切口不要太大，否则压力过小不易固定。灌注体积分数4%多聚甲醛时一定要缓慢进行，否则眼球固定不好，晶状体较软，视网膜不易剥离。②剥离视网膜时一定要小心，视网膜位于眼球壁的内层，组织比较薄，而且附着在色素层上，剥离过程中很容易破碎。因此，去除晶状体后，将眼球壁剪开成若干等份，轻轻剥离出视网膜。③剪切视网膜时，视网膜在载玻片上容易卷曲，先用刀片在两边切开，用毛笔轻轻刷开视网膜，然后在另外两边切开视网膜，使呈“十”字形。注意毛笔一定要用清水冲洗一下，避免粘上杂质，影响后面实验结果。④固定时间要掌握好。一般成年小鼠固定1～2 h，幼鼠固定2～3 h。时间太短，达不到固定效果；时间太久，视网膜容易脆，不利于之后的实验操作。⑤实验过程中用到的PBS缓冲液和多聚甲醛固定液最好是新鲜配制的，放置时间最好不要超过1 mon。

经过这样改良的视网膜剥离铺片技术，可得到完整的视网膜形态，在进行形态学观察或电生理研究时，细胞形态好，视网膜不易破碎。

[1] 徐玉环，徐艳峰，刘颖. 视网膜血管铺片技术的改进[J]. 中国比较医学杂志，2015,25(5):50-53.

[2] 孟丽娜，刘廷，董晓光. 小鼠血管灌注造影视网膜铺片操作技术及技巧探讨[J]. 眼科新进展，2009,29(9):663-666.

[3] Yao Huanling, Wang Tianshi, Deng Jiexin, et al. The development of blood-retinal barrier during theinteraction of astrocytes with vascular wall cells[J]. Neural Regeneration Research, 2014,9(10):1047-1054.

[4] 姚焕玲，王天仕，刘鼎，等. 啮齿类动物视网膜血管系统的发育[J]. 解剖学报，2013,44(3):379-385.

[5] Katharina D, Marcus K, Albert C, et al. Acid sphingo-myelinase (aSMase) deficiency leads to abnormal microglia behavior and disturbed retinal function[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2015,464:434-440.

[6] 窦方方，刘廷，董晓光. 小鼠视网膜铺片免疫荧光染色技术的探讨[J]. 眼科新进展，2010,30(8):714-717.

[7] 穆小云，梁爽，邓锦波. DiI示踪标记固定脑组织内神经元及其突起的方法[J]. 解剖学杂志，2015,38(2):212-214.

[8] 崔占军，赵凯冰，牛艳丽，等. 细胞膜红色荧光探针(Dil)光学转换及其电镜样本的制备[J]. 解剖学报，2010,41(4):631-633.

[责任编辑时红]

The detachment and stretched slice of mouse-retina

Institute of Neurobiology, School of Life Science, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

〔Objective〕We tried to improve the methods of retinal detachment and stretched slice in mice. 〔Methods〕The C57BL/6J mice were utilized to detach mouse retina and to prepare retina-stretched slice under dissection microscope, and in the meantime, the effects were evaluated with immunofluorescent labeling and Dil diolistic assay. 〔Results〕The modified methods can be used to detach retina and prepare stretched slice with satisfied results. With immunofluorescent labeling and Dil diolistic assay, the histological structure, including the vessels and neurons, could be visualized well. 〔Conclusion〕The detached and stretched retina can be applied in the researches of histology and electrophysiology.

retinal detachment; stretched slic; immunofluorescent labeling; Dil diolistic assay

1672-7606(2016)03-0189-03

2015-11-17

河南省自然科学基金(12B180017)；河南大学省属高校科研项目(0000A40475, 0000A40356)

李瑞萍(1992-)，女，河南开封人，河南大学在读硕士生，从事生物医学的学习和研究。

邓锦波(1957-)，男，江西高安人，博士，教授，从事发育神经生物学的研究工作。

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