尾叶香茶菜挥发油的提取工艺及其抗菌和抗氧化作用

王　霞，许菊香,于晓明,徐亚维

(1.吉林农业科技学院，吉林　吉林　132101；2.长白山动植物资源利用与保护吉林省高校重点实验室，吉林　吉林　132101；3.磐石市农民科技教育中心，吉林　磐石　132300)



尾叶香茶菜挥发油的提取工艺及其抗菌和抗氧化作用

王霞1,2，许菊香3,于晓明1，2,徐亚维1,2

(1.吉林农业科技学院，吉林吉林132101；2.长白山动植物资源利用与保护吉林省高校重点实验室，吉林吉林132101；3.磐石市农民科技教育中心，吉林磐石132300)

研究尾叶香茶菜挥发油的最佳提取方法、提取工艺及其抗菌和抗氧化能力。采用水蒸气蒸馏法(SD法)和CO2超临界流体萃取法(SFE-CO2法)提取尾叶香茶菜挥发油，通过正交试验优化提取工艺，采用体外抑菌试验和对DPPH自由基的清除能力试验研究其抗菌和抗氧化能力。结果表明，SD法的最佳提取工艺是浸泡时间8 h，料液比1∶6，蒸馏时间7 h，平均得油率为0.186%；SFE-CO2法的最佳提取工艺是萃取压力30 MPa，萃取温度50℃，萃取时间80 min，平均得油率为0.440%；2种方法所提挥发油均具有一定的抑菌和DPPH自由基的清除能力，且SFE-CO2法所提挥发油的抗菌和抗氧化能力均高于SD法所提挥发油，同种方法所提挥发油的抑菌效果：枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌；对DPPH自由基的清除能力强弱：SFE-CO2法提取挥发油>SD法提取挥发油>Vc。优化的2种提取方法稳定性好，其中SFE-CO2法周期短、工艺流程简单、得油率高、抗菌和抗氧化性能好，适宜在工业生产中推广。

尾叶香茶菜；挥发油；提取工艺；抗菌；抗氧化

尾叶香茶菜Isodonexcisa(Maxim.) Hara，系多年生草本植物，主要分布于我国吉林、甘肃、山西等省以及日本、朝鲜、俄罗斯的远东地区[1]。尾叶香茶菜全草入药，具有清热解毒、健胃、活血等功效，可用于治疗胃炎、膀胱胀痛和感冒发热等疾病[2]。目前，对尾叶香茶菜的研究主要集中在化学成分方面，尤其是二萜类化合物的分离、结构鉴定及药理活性等方面，药理研究表明，这些化合物可以显著抑制人体宫颈癌细胞、黑色素瘤细胞、肺癌细胞等肿瘤细胞的增殖[3]。

挥发油是存在于植物中的可随水蒸蒸汽蒸馏出来的油状液体，多具有抗菌、杀虫、抗氧化等生物活性，不同植物的挥发油组成成分不同，生物活性也不相同[4]。目前，对尾叶香茶菜挥发油的研究较少，仅见那微、南敏伦对尾叶香茶菜挥发油的化学成分进行了分析[1,5]，而关于尾叶香茶菜挥发油的提取工艺及生物活性方面的研究则尚无报道。目前香茶菜属植物的挥发油都是从阴干后的材料中提取的，由于挥发油易挥发，阴干耗时长，因此很容易流失一些挥发油成分，降低得油率。本试验首次以新鲜尾叶香茶菜为材料，利用水蒸气蒸馏法(SD法)和CO2超临界流体萃取法(SFE-CO2法)提取挥发油，借助正交试验优化提取工艺条件，并对2种方法提取挥发油进行抗菌和DPPH自由基清除能力测定与分析，为尾叶香茶菜的进一步开发利用提供理论指导。

1　材料与方法

1.1材料与菌株

材料：野生尾叶香茶菜，于2015年7月采自吉林市龙潭山，经吉林农业科技学院孙仓教授鉴定为尾叶香茶菜。

供试菌株：金黄色葡萄球菌Staphyloccocusaureus、大肠杆菌Escherichiacoli和枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，均由吉林农业科技学院微生物实验室提供。

1.2设备与试剂

HA121-50-1型超临界萃取装置设备(江苏南通华安超临界萃取有限公司)，R210旋转蒸发仪(瑞士步琪)，电热恒温培养箱(上海鑫福电子科技有限公司)，723型可见分光光度计(上海光学仪器一厂)。

DPPH自由基(Sigma公司)；无水乙醚，无水硫酸钠、LB培养基等，均为分析纯。

1.3试验方法

1.3.1挥发油的提取

(1)SD法：称取新鲜尾叶香茶菜1 000 g，剪碎，置于旋转蒸发仪中浸泡一段时间(表1)，然后提取挥发油，提取温度100℃，提取液用无水乙醚萃取，无水硫酸钠干燥[6]，收集挥发油，计算得油率。

得油率/%=(挥发油质量/原材料质量)×100%[7]

根据预试验，考查浸泡时间、料液比和蒸馏时间对尾叶香茶菜得油率的影响，每个因素设3个水平，按照L9(33)正交表进行试验，考查因素表如表1所示。

(2)SFE-CO2法：称取新鲜尾叶香茶菜200 g，剪碎，放入萃取釜中提取。调节萃取压力和萃取温度，同时设置分离釜I：压力8 MPa，温度50℃；分离釜：压力10 MPa,温度55℃，待压力平衡后计算萃取时间，一段时间后收集萃取物。

根据预试验，考查萃取压力、萃取时间和萃取温度对尾叶香茶菜得油率的影响，每个因素设3个水平，按照L9(33)正交表进行试验，考查因素表如表3所示。

1.3.2抑菌活性试验

(1)供试菌液的制备：利用LB斜面培养基分别活化3种供试菌株，收集对数生长期菌株于生理盐水中，制成含量约为1×108cfu·mL-1的供试菌液，备用[8]。

(2)抑菌圈直径的测定：将用SFE-CO2法在最佳工艺条件下提取的挥发油和SD法提取的挥发油分别与无水乙醚按1∶1体积比混匀，用滤纸片扩散法测定抑菌效果：将3种供试菌液分别涂布在平板上，将直径为6 mm的无菌滤纸浸于挥发油溶液中，10 min后取出晾干，置于含菌平板上，每皿3片，1片为含挥发油滤纸，1片为只浸有乙醚的滤纸(空白对照)，1片为浸有0.1 mg·mL-1庆大霉素的滤纸(阳性对照)，重复试验4次，37℃培养24 h，测定抑菌圈直径[9]。

(3)最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定：采用2倍连续梯度稀释法，用无水乙醚稀释挥发油原液，使挥发油的体积分数依次为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μL·L-1，将无菌滤纸片分别浸泡于不同浓度的挥发油稀释液中，使之充分吸收并晾干后，置于含菌平板上，每皿3片，其中1片为只浸有乙醚的滤纸(空白对照)，重复试验4次，37℃培养24 h，测定尾叶香茶菜挥发油的MIC，将低于挥发油MIC的未长菌的平板，继续培养24 h，仍无菌生长的最低浓度即为挥发油的MBC[10]。

1.3.3DPPH自由基清除试验参照邓大贵等[11]的方法并改良，取2 mL不同质量浓度的挥发油(5、15、30、45 μg·mL-1)和2 mL 0.2 mmol·L-1DPPH自由基强烈震荡混匀，避光静置30 min，在517 nm处测定吸光值，乙醇代替DPPH自由基为对照组，乙醇代替挥发油样品为空白组，维生素C(Vc)为阳性对照，试验重复3次，计算DPPH自由基清除率。

清除率/%={[1-(A样品-A对照)]/A空白}×100%[11]

2　结果与分析

2.1SD法提取尾叶香茶菜挥发油

正交试验及极差分析结果如表1所示，可以看出RC>RA>RB，极差越大对尾叶香茶菜挥发油得油率的影响越大，反之影响越小，因此各因素对得油率的影响次序是：C(蒸馏时间)>A(浸泡时间)>B(料液比)，由方差分析结果(表2)可以看出，A(浸泡时间)因素和C(蒸馏时间)因素对得油率有显著影响(P<0.05)，B(料液比)因素对得油率无显著影响，影响程度排序与极差分析结果一致。综上，SD法提取尾叶香茶菜挥发油的最佳工艺为A3B2C2，即浸泡时间8 h，料液比1：6，蒸馏时间7 h，在此条件下进行验证试验，重复3次，得油率依次为0.183%、0.188%、0.187%，平均得油率为0.186%，该最佳工艺条件重复性良好。

表1　SD法正交试验设计与结果

表2　SD法方差分析

注：R2=0.991(调整R2=0.966)。

2.2SFE-CO2法提取尾叶香茶菜挥发油

正交试验及极差分析结果如表3所示，可以看出RA>RB>RC，各因素对尾叶香茶菜挥发油得油率的影响次序是：A(萃取压力)>B(萃取温度)>C(萃取时间)，方差分析结果如表4所示，可以看出，萃取压力和萃取温度对得油率影响显著(P<0.05)，萃取时间对得油率影响不显著，影响程度排序与极差分析结果一致。综上，SFE-CO2法提取尾叶香茶菜挥发油的最佳工艺条件为A2B2C2，即萃取压力30 MPa，萃取温度50℃，萃取时间80 min，但是由于萃取时间对得油率影响不大，缩短时间又可以缩短工业生产周期，故笔者认为应选择的最佳工艺条件是A2B2C1，在此条件下进行验证试验，重复3次，得油率依次为0.438%、0.440%、0.443%，平均得油率为0.440%，该最佳工艺条件重复性良好。

表3SFE-CO2法正交试验设计与结果

Table 3Orthogonal test and analysis on results for SFE extraction

表4　SFE-CO2 法方差分析

注：R2=0.992(调整R2=0.966)。

2.3抑菌活性试验

抑菌圈是挥发油在培养基中扩散抑制菌株生长形成的透明圈，最低抑菌浓度(MIC)是能够抑制细菌生长的最低抑菌剂浓度，最低杀菌浓度(MBC)是能够杀死99.9%以上菌株的抑菌剂浓度，因此抑菌圈越大，MIC和MBC越小，抑菌活性就越强。尾叶香茶菜挥发油的抑菌活性试验结果如表5所示，可知SFE-CO2法和SD法所提挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均具有较强的抑杀作用，同种方法所提挥发油对枯草芽孢杆菌抑杀效果最好，金黄色葡萄球菌次之，对大肠杆菌抑杀效果较弱。对于同一种供试菌株，SFE-CO2法提取挥发油比SD法提取挥发油对供试菌株的抑菌圈直径大，MIC小，MBC也小于或等于SD法所提挥发油，因此SFE-CO2法所提挥发油对3种供试菌的抑菌活性高于SD法所提挥发油。

表5　尾叶香茶菜挥发油的抑菌活性

注：A为金黄色葡萄球菌，B为大肠杆菌，C为枯草芽孢杆菌, -表示无抑菌圈。

2.4对DPPH自由基的清除试验

DPPH自由基，全称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种含有3个苯环的稳定性较好的自由基，醇溶液为紫色，在517 nm处有最大吸收峰，DPPH自由基具有单电子，可与抗氧化剂配对使其吸收减少，因此吸光值越小，对自由基的清除率就越大，抗氧化性也就越强[12]。尾叶香茶菜挥发油对DPPH自由基的清除率如图1所示，可知SD法和SFE-CO2法所提挥发油对DPPH自由基均具有显著的清除作用，在测定浓度范围内，对DPPH自由基的清除能力均随挥发油浓度升高而增强，SD法曲线回归方程为Y=1.713X+13.720，R2=0.994，半数清除率EC50为21.179 μg·mL-1，SFE-CO2法曲线回归方程为Y=1.822X+16.211，R2=0.982，半数清除率EC50为18.545 μg·mL-1，以半数清除率EC50为评价指标，两种方法所提挥发油与阳性对照Vc相比差别显著，结果为SFE-CO2法提取挥发油(18.545 μg·mL-1)SD法提取挥发油>Vc。

3　讨论与结论

作为植物挥发油提取的传统方法，SD法的优点是设备简单、操作方便、成本低廉和不污染环境，缺点是提取时间长、成分易挥发、提取率低、挥发油长时间受热易焦化变质[13]。试验中SD法提取尾叶香茶菜挥发油的最佳蒸馏时间是7 h，得油率为0.186%。SFE-CO2法是20世纪70年代末发展起来的一种新型物质分离技术，SFE-CO2具有优良的溶剂能力，能够有效分离基质和萃取物[14]。SFE-CO2法提取植物挥发油具有得油率高、杂质少、提取时间短、操作方便等优点，本试验利用该法提取尾叶香茶菜挥发油的最佳萃取温度是50℃，系统封闭和低温可以避免热敏性和易氧化成分的破坏，最佳萃取时间是80 min，低于SD法提取时间的1/5，大大缩短了生产周期，该条件下的得油率为0.440%，是SD法的2.366倍。抑菌活性试验表明SD法和SFE-CO2法提取的挥发油均能显著抑杀2种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和1种革兰阴性菌(大肠杆菌)，DPPH自由基清除试验表明2种方法提取挥发油均具有较显著的抗氧化作用， SFE-CO2法提取挥发油的抗菌、杀菌和抗氧化活性均高于SD法提取挥发油，因此笔者认为利用SFE-CO2法提取尾叶香茶菜挥发油值得推广应用。

综上可知SFE-CO2法提取的挥发油具有显著的体外抑菌和抗氧化能力，但对挥发油中发挥作用的具体活性成分并不清楚，下一步将对尾叶香茶菜挥发油的活性成分进行分离和鉴定，为尾叶香茶菜的开发应用以及新药的研发奠定基础。

[1]那微,鲍建材,刘刚,等.中药尾叶香茶菜研究现状及药用前景展望[J].人参研究, 2006,18(1)：13-17.

[2]张宁,李春.尾叶香茶菜化学成分研究[J].中药材,1998,21(7)：347-349.

[3]刘亚男,金永日,钟加滕,等.尾叶香茶菜二萜类化合物B对人宫颈癌细胞的生长抑制作用及其机制[J].吉林大学学报：医学版,2010,36(1)：54-58.

[4]秦姣.毛竹叶挥发油的提取及抑菌作用的研究[D].北京：北京林业大学，2010.

[5]南敏伦,赵雪娇,张玲,等.尾叶香茶菜挥发油的成分研究[J].中国医药指南,2010,8(10)：5-6.

[6]纳智.疏花毛萼香茶菜挥发油化学成分的研究[J].中国中药杂志,2005,30 (16)：1268-1270.

[7]陈联邦.辛夷挥发油不同提取工艺的优化及成分比较[D].长春：吉林大学,2007.

[8]赵兵,郝萍,高昂,等.缬草与蜘蛛香挥发油的抗菌抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发,2013,25(8)：1037-1040,1066.

[9]耿红梅,张彦,苗庆峰,等.白花菜子挥发油化学成分、抗氧化活性和抑菌活性的研究[J].现代食品科技,2014,30(11)：194-199.

[10]葛晓晓,姚成,边敏,等.长春七根挥发油的测定及抑菌活性研究[J].南京师范大学学报：工程技术版,2015,15(1)：67-72.

[11]邓大贵,叶青,叶红德,等.DPPH·法评价Vc、异Vc及其衍生物的抗氧化性能[J].食品工业科技,2008,29(4)：113-115.

[12]樊金玲,罗磊,武涛,等.沙棘籽原花色素与葡萄籽原花青素抗氧化活性的比较[J].食品与机械,2007,23(2)：26-30.

[13]杜丽君.胡椒木精油提取、分析及抗氧化特性研究[D].福州：福建农林大学,2013.

[14]曾锁林,丁焕文.CO2超临界流体萃取的新进展[J].医疗卫生装备,2009, 30(2)： 31-33.

(责任编辑：黄爱萍)

Extraction and Antibacterial and Antioxidative Properties of Volatile Oil fromIsodonexcia

WANG Xia1,2, XU Ju-xiang3, YU Xiao-ming1,2，XU Ya-wei1,2

(1.CollegeofJilinAgricultureScienceAndTechnology,Jilin,Jilin132101,China;2.KeyLaboratoryofChangbaiMountainAnimalandPlantRescources′UtilizationandProtectionofUniversitiesinJilinProvince,Jilin,Jilin132101,China;3.Farmers′ScienceandTechnologyEducationCenterofPanshiCity,Panshi,Jilin132300,China)

Extraction, as well as the antibacterial and antioxidative properties, of the volatile oil fromIsodonexciawere studied. The volatile oil was extracted by means of the steam distillation (SD)and supercritical CO2(SFE)method. The processes were optimized by an orthogonal test and the results were compared.Aninvitroantibacterial test and a para-DPPH-radical scavenging ability determination were conducted on the oil samples obtained. The results showed that the optimized extraction conditions for the SD method included substrate soaking for 8 h, a substrate:solvent ratio of 1∶6, and distillation for 7 h to get an oil yield of 0.186%.Whereas, those for the SFE method consisted of a processing pressure of 30 MPa and extract at 50℃ for 80 min to achieve an oil yield of 0.440%. The antibacterial and antioxidation properties of the volatile oil extracted by SFE were higher than those of the oil extracted by SD method. The bacteriostatic efficacies against various pathogens of the oils were in the order of:Bacillussubtilis>Staphyloccocusaureus>Escherichiacoli. The para-DPPH-radical scavenging ability of the oil extracted by SFE was the greatest, followed by that of SD and vitamin C. Both optimized processes were stable, however, the SFE method was considered more suitable for the extraction because its process cycle was shorter, oil yield higher,andantibacterial and antioxidant efficacies of the extracted volatile oil greaterthan the SD method.

Isodonexcia;volatile oil;extractionprocess;antibacterial; antioxidative

2016-03-12初稿；2016-04-14修改稿

王霞(1978-)，女，硕士，讲师，研究方向：植物分子生物学及天然产物分离(E-mail：wangxhangj@126.com)

长白山重点实验室培育项目(吉农院合字[2013]第s016 号)

R 284

A

1008-0384(2016)07-747-05

王霞，许菊香,于晓明，等.尾叶香茶菜挥发油的提取工艺及其抗菌和抗氧化作用[J].福建农业学报，2016，31(7)：747-751.

WANG X，XU J-X，YU X-M，et al.Extraction and Antibacterial and Antioxidative Properties of Volatile Oil fromIsodonexcia[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：747-751.