响应面优化酶法提取泥鳅多糖工艺的研究

党晓妍，王　茵，苏永昌，刘淑集，吴成业，陈丽娇

(1.福建农林大学食品科学学院，福建　福州　350002；2.福建省水产研究所/福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建　厦门　361013)



响应面优化酶法提取泥鳅多糖工艺的研究

党晓妍1，王茵2*，苏永昌2，刘淑集2，吴成业2，陈丽娇1

(1.福建农林大学食品科学学院，福建福州350002；2.福建省水产研究所/福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建厦门361013)

为优化泥鳅多糖的超声波酶法提取工艺，样品先在100 W的超声波仪中超声20 min，然后在酶法单因素试验基础上，选取酶解温度、酶解时间及中性蛋白酶添加量为自变量，多糖提取率为响应值，采用中心组合设计的方法，研究各自变量及其交互作用对多糖提取率的影响。利用响应面分析方法，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型，并确定泥鳅多糖提取工艺的最佳条件：酶解作用温度50℃、酶解作用时间 6 h、中性蛋白酶添加量 5%，在此条件下，多糖提取率为 5.37%。

泥鳅；多糖；超声波酶法；响应面

泥鳅，鳅科动物，肉、体表黏液或全体均可入药，具有较高的药用价值，被喻为“水中人参”[1-2]。研究表明，泥鳅多糖具有保护肝损伤、抗疲劳、抗炎、抗肿瘤、降血糖血脂、免疫调节、耐缺氧等多种药理活性，具有重要的保健功效和药用价值[3-4]。钦传光等采用醇沉法和有机溶剂萃取法提取泥鳅体表黏液的多糖成分[5]；董陆陆等结合碱提法和蛋白酶法去除蛋白杂质提取泥鳅黏多糖[6]；张宏伟通过碱液浸泡提取泥鳅黏液、表皮和全身中的水溶性多糖[7]。传统的多糖提取方法为水提醇沉，操作简单、工艺稳定，但提取效率低、溶剂消耗量大[8]。近年来，生物酶技术、超声技术在多糖的提取中得到广泛的应用，生物酶的降解作用和超声波的空化作用有助于破除细胞壁，使细胞中的有效成分充分溶出，在温和的条件下，既保护多糖活性不被破坏，又提高提取效率[9-11]。本试验在超声辅助的基础上采用生物酶解法提取泥鳅多糖，通过响应面试验设计优化泥鳅多糖的提取工艺，期望为泥鳅的高值化开发利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料、试剂和仪器

1.1.1材料与试剂新鲜活泥鳅，由霞浦县金泉泰生物科技有限公司提供；葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；木瓜蛋白酶(8×105U·g-1)，动物蛋白水解酶(1×105U·g-1)，中性蛋白酶(5×104U·g-1)，菠萝酶(8×105U·g-1)，风味酶(1.5×104U·g-1)均为南宁庞博生物工程有限公司。

1.1.2仪器BGZ-246电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司；UV-3200扫描型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；粉碎机，永康市诺邦富贸易有限公司；5804/5804 R 离心机，Eppendorf公司；KQ-500DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司：SHZ-D(Ш)循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司；数显恒温水浴锅HH-6，国华电器有限公司；Infinite 200 Pro NanoQuant酶标仪，上海安景科技有限公司。

1.2试验方法

1.2.1泥鳅多糖的提取工艺流程图鲜活泥鳅经清洗、切段、低温干燥、粉碎、制成粉末状，低温保存备用。取10 g冻干泥鳅粉末于250 mL锥形瓶中，加入200 mL蒸馏水，先置于功率100 W的超声波仪中，超声20 min。然后再加入适量的生物酶制剂，调节酶解温度，酶解一定时间，最后高温灭酶，7 000 r·min-1离心10 min取溶液，检测多糖含量，同时，溶液进行真空浓缩，加入乙醇醇沉，静置过夜，再离心取沉淀，经冷冻干燥获得泥鳅粗多糖样品。

超声辅助蛋白酶法提取泥鳅多糖的工艺路线如下：

新鲜活泥鳅→清洗干净→干燥→粉碎→水提→超声处理→生物酶解→高温灭酶→离心→浓缩→醇沉→静置过夜→离心取沉淀→冷冻干燥→粗多糖。

1.2.2多糖含量的测定硫酸-苯酚法测多糖含量[12]。

标准曲线绘制：将葡萄糖置于105℃烘箱中烘至恒重，取100 mg于100 mL容量瓶中定容，再稀释10倍，得0.1 mg·mL-1标准葡萄糖溶液。取0.1 mg·mL-1标准葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,加蒸馏水至2 mL,分别加1 mL浓度5%的苯酚溶液和5 mL浓硫酸混匀，放置20 min，于490 nm波长下测吸光值。葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

样品多糖含量检测：取1 mL提取液于50 mL容量瓶中定容，再取2 mL定容液,加1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL浓硫酸混匀后，放置20 min，490 nm波长下测吸光值。通过比对标准曲线获得样品中的多糖提取量。

多糖提取率计算公式[13]：多糖提取率=(多糖提取量/泥鳅干粉质量)×100%。

1.2.3不同酶提取泥鳅多糖的试验分别选取木瓜蛋白酶、动物蛋白水解酶、中性蛋白酶、菠萝酶和风味酶，经超声工艺处理后，在各蛋白酶的最优酶解工艺下进行酶解(表1)，选取最优的酶再进行单因素和响应面试验。

表1　蛋白酶酶解条件

1.2.4酶法提取泥鳅多糖工艺的单因素试验酶解时间：在加酶量为3%，温度为50℃的条件下，设定酶解时间分别为：2、4、6、8、10 h；酶解温度：加酶量为3%，酶解6 h，设定酶解温度分别为30、40、50、60、70℃；加酶量：酶解温度50℃，酶解6 h，设定加酶量分别为1%、3%、5%、7%、9%。

1.2.5酶法提取泥鳅多糖工艺的响应面优化采用Box-Behnken Design(BBD)的试验设计方法，对酶法提取泥鳅多糖的工艺进行响应面优化，分别对酶解时间，酶解温度，酶添加量3个因素，在单因素的基础上进行3因素3水平试验，以多糖提取率为响应值，通过响应曲面分析对提取条件进行优化。

表2　响应面试验因素水平设计

2　结果与分析

2.1不同生物酶的提取对泥鳅多糖提取率的影响

选用不同的酶提取泥鳅多糖，由图1可以看出，中性蛋白酶的提取率最高，达到5.24%，其次为木瓜蛋白酶、菠萝酶、风味酶以及动物蛋白水解酶。因此，选择中性蛋白酶提取泥鳅多糖。

2.2酶法提取泥鳅多糖的单因素试验结果

2.2.1酶解时间对泥鳅多糖的影响泥鳅干粉溶液经超声波辅助浸提后，加入3%的中性蛋白酶，在酶解温度为50℃的条件下，分别酶解2、4、6、8、10 h，泥鳅多糖提取率如图2所示。

经超声波辅助浸提后的泥鳅多糖溶液，其多糖提取率为2.79%。再经酶解处理，多糖提取率继续增加，且随着酶解时间的增加，提取率逐渐升高，6 h到达最大，为4.10%，之后随着酶解时间的增加，多糖提取率反而下降。这可能由于在酶的作用下，酶和底物作用充分，多糖提取率增加，但时间过长酶的活性逐渐减弱，所以多糖提取率有所减弱[14]。因此，酶解最适时间为6 h。

2.2.2酶解温度对泥鳅多糖的影响加入3%的中性蛋白酶，在温度为30、40、50、60、70℃的条件下，酶解6 h，多糖提取率结果如图3所示。

由图3可知，随着温度的升高，多糖提取率先增高后下降，50℃时提取率达到最高，为4.62%。这是因为酶活力与温度有着密切的关系，温度过低，酶不能充分发挥其作用，温度过高又会破坏酶的结构，使酶的活性受抑制[15-16]。因此，提取泥鳅多糖的最适酶解温度为50℃。

2.2.3酶添加量对泥鳅多糖的影响加入1%、3%、5%、7%、9%等不同浓度梯度的中性蛋白酶，在酶解温度50℃下酶解6 h，结果如图4所示。

由图4可知，中性蛋白酶的添加量对多糖提取率有着显著影响，当中性蛋白酶用量低于5%时，随着酶添加量的增加，多糖提取率快速增加，最大为5.34%，此后继续加大酶添加量时，多糖提取率几乎不变，甚至有所下降。这可能是由于随着酶添加量的增加，部分多糖可能产生降解作用，从而导致多糖提取率略有降低[17]。因此，确定中性蛋白酶最适用量为5%。

2.3超声波酶法提取泥鳅多糖的响应面优化试验结果

2.3.1响应面试验设计及结果在单因素实验基础上，根据Box-Behnken Design中心组合实验设计原理，以酶解时间(A)、酶解温度(B)、酶添加量(C)为因子，多糖提取率为响应值，设计3因素3水平的响应面实验，结果见表3。

使用Design Expert7.0软件对表3的试验结果分析，得到表4回归方程方差分析表，利用软件进行非线性回归的二次多项式拟合，得到预测模型如下：y=5.30+5.000E-003A+0.075B+0.79C+0.022AB-7.500E-003AC+0.048BC-0.017A2-0.21B2-1.24C2。回归方差分析显著性检验表明，该模型回归显著(P<0.05)，失拟项不显著(P>0.05)，且该模型R2=0.9996,说明该模型与实际实验拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于泥鳅多糖提取工艺实验的预测。

由表4可以看出,B、C、B2、C2达到极显著水平，BC为显著水平，即酶解温度和酶添加量达到极显著水平，酶解温度和酶添加量的交互作用达到显著水平，在超声波酶法提取泥鳅多糖的工艺参数中，影响多糖提取率的因素排列：C>B>A，即酶添加量>酶解温度>酶解时间。

表3　响应面试验设计及结果

表4　回归方程方差分析

2.3.2各因素之间的交互作用酶法提取泥鳅多糖工艺中酶解时间、酶解温度、酶添加量3个因素之间交互作用对提取多糖提取率的影响如图5所示。

图5直观地反映了各因素对响应值影响，由图可以看出，存在极值条件应该在圆心处。根据软件分析，得到泥鳅多糖提取最佳条件为酶解温度52.31℃，酶解时间6.47 h，中性蛋白酶添加量为5.64%，在此条件下，多糖提取率的理论值为5.43%。为检验预测结果可靠性，采用上述最优提取条件进行泥鳅多糖提取，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为酶解温度50℃，酶解时间6 h，中性蛋白酶添加量 5%，3 次平行试验得到的实际提取率为 5.37%，与最优理论值相近。

3　结　论

经单因素试验和响应面分析，得到超声波酶法提取泥鳅多糖的最优工艺条件为：酶解温度50℃，酶解时间6 h，中性蛋白酶添加量 5%，在此条件下，多糖提取率为5.37%。在之前的研究试验中，仅经过超声波浸提法获得的泥鳅多糖提取率为2.79%。可见，酶法提取显著地提高了泥鳅多糖的提取率。该研究方法具有高效、节能、省时、无污染等优点，期望研究结果对泥鳅多糖的高效开发利用具有一定的推动作用。

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(责任编辑：柯文辉)

Response Surface Optimization of Enzymatic Extraction Loach Polysaccharides

DANG Xiao-yan1, WANG Yin2*,SU Yong-chang2, LIU Shu-ji2, WU Cheng-ye2,CHEN Li-jiao1

(1.CollegeofFoodScience，FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002，China; 2.KeyLaboratoryofCultivationandHigh-valueUtilizationofMarineOrganismsinFujianProvince,FisheriesResearchInstituteofFujian,Xiamen，Fujian361013,China)

In order to optimize the extraction process of polysaccharides loach ultrasonic enzyme samples in 100 W ultrasound first ultrasonic instrument 20 min, and then in the enzymatic test based on a single factor, select the hydrolysis temperature, reaction time and dosage neutral protease from variable polysaccharide extraction rate response, the central composite design, study their interactions on polysaccharide extraction rate. The response surface analysis methods, simulated prediction model quadratic polynomial regression equation and determine the best conditions of the Loach Polysaccharide Extraction Process: enzymatic hydrolysis temperature of 50℃, enzymatic hydrolysis time 6 h, neutral protease amount of 5% in under this condition, the polysaccharide was 5.37%.

loach; polysaccharides; ultrasonic enzymatic; response surface

2016-05-10初稿；2016-06-20修改稿

党晓妍(1993-)，女，硕士研究生，研究方向：食品加工与安全专业(E-mail: 358672095@qq.com)

王茵(1983-)，女，助理研究员，研究方向：水产品加工及生物活性物质(E-mail:12687622@qq.com)

福建省农业“五新”工程建设项目(闽发改投资[2015]489号)；福建省海洋高新产业发展专项项目(闽海洋高新[2015]18号)；闽台重要海洋生物资源高值化开发技术公共服务平台(2014FJPT01)；福建重要海洋经济生物种质库与资源高效开发技术公共服务平台(14PZY017NF17)

R 28

A

1008-0384(2016)07-752-06

党晓妍，王茵，苏永昌，等.响应面优化酶法提取泥鳅多糖工艺的研究[J].福建农业学报，2016，31(7)：752-757.

DANG X-Y，WANG Y，SU Y-C，et al.Response Surface Optimization of Enzymatic Extraction Loach Polysaccharides[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：752-757.