应用响应面法优化普通小球藻的絮凝工艺

马志欣，胡小丽，成　婕，高　坤，邓祥元

(江苏科技大学生物技术学院，江苏　镇江　212018)



应用响应面法优化普通小球藻的絮凝工艺

马志欣，胡小丽，成婕，高坤，邓祥元*

(江苏科技大学生物技术学院，江苏镇江212018)

以聚合氯化铝(Poly aluminium chloride, PAC)为絮凝剂，利用响应面法对普通小球藻Chlorellavulgaris的絮凝工艺进行优化。研究结果表明：影响C.vulgaris絮凝效率的主次因素顺序为絮凝时间>C.vulgaris初始OD值>PAC浓度；C.vulgaris的最佳絮凝工艺为：PAC浓度为57 mg·L-1，C.vulgaris初始OD值为2.06，絮凝时间为18 min。在此絮凝条件下，C.vulgaris的絮凝效率为95.82%。研究结果将为进一步研究C.vulgaris的絮凝采收工艺提供数据参考和技术支持。

普通小球藻；聚合氯化铝；絮凝工艺；响应面法

普通小球藻Chlorellavulgaris，C.vulgaris是一种球形单细胞藻类，具有光合效率高，生长速度快，种类繁多，分布广泛，营养丰富，适应性强等特点[1-2]，在光合自养条件下，C.vulgaris还具有高效的CO2固定转化能力，其对CO2的转化效率是陆地高等植物的10～50倍[3-4]。目前，C.vulgaris因富含多糖、蛋白质、色素、脂肪酸等多种营养成分，并可人工条件下大规模培养，已被广泛应用于食品、医药和生物能源等领域[5-7]。虽然C.vulgaris具有良好的应用前景，但是其产业化程度仍不高，其中最主要的原因之一就是其采收成本过高，据估算，其采收成本约占整个生产成本的20%～30%[8]。C.vulgaris之所以采收困难，是因为其个体微小，培养浓度低，可以形成稳定的分散体系。因此，寻找一种高效率、低成本、应用广的采收方法是C.vulgaris产业化的必由之路。目前，用于微藻采收的方法主要有沉降法、离心法、过滤法和絮凝法。沉降法是依靠重力作用进行采收的方法，因其采收效率较低，常与絮凝法结合使用；离心法是借助离心力作用进行采收的方法，其效率较高，但能耗大、成本高[9]；过滤法是利用过滤介质实现采收的方法，该法在实际生产过程中常出现滤膜堵塞和污染等问题；絮凝法是通过添加絮凝剂进行采收的方法，其机理是通过电中和、架桥或/和网捕作用，使分散的带电荷藻细胞聚集到一起，以达到采收的目的，具有采收效率高、成本低，且既可单独使用，又可与沉降法、离心法和过滤法联合使用等优点，其中无机絮凝法是应用最为广泛的采收方法。丁进锋等[10]进行了聚合氯化铝(Poly aluminium chloride, PAC)絮凝小球藻的动力学研究，发现PAC絮凝小球藻时不符合一级动力学方程，但可用二级动力学模型进行拟合，絮凝效率高达98.6%，表明PAC絮凝小球藻前景广阔。本试验对PAC絮凝C.vulgaris的影响因素进行了探究，并且利用响应面法对影响因素进行优化，以探索最优絮凝工艺，降低C.vulgaris采收成本，为利用PAC絮凝C.vulgaris的采收工艺提供理论基础和技术支持，加速C.vulgaris的产业化进程。

1　材料与方法

1.1试验材料

普通小球藻Chlorellavulgaris购自中国科学院野生生物种质库(淡水藻种库)，在无菌条件下，将藻种转接到BG-11培养基[11]中，并利用本试验研制的微藻通气培养装置进行高密度培养，培养条件为：温度25℃，光强3 000 lx，光周期为12 h L∶12 h D；通气速率为1 vvm (L air/Lculture/min)。

聚合氯化铝(PAC)购自上海麦克林生化科技有限公司，其他试剂，如NaOH、HCl等为上海国药集团化学试剂有限公司生产的分析纯试剂。

本试验所用仪器有UV-1800PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)，光照培养架，微藻通气培养装置(本实验室研制)。

1.2试验方法

1.2.1小球藻生物量的测定测定小球藻藻液在680 nm波长下的吸光度值，用以间接表示小球藻生物量[12]。

1.2.2絮凝效率的测定在50 mLC.vulgaris培养液中加入一定浓度的PAC，一定时间后，在680 nm波长下测其OD值，根据所得OD值，计算C.vulgaris的絮凝效率。计算公式为絮凝效率=(OD0-ODt)/OD0×100%[13]，其中，OD0表示C.vulgaris初始OD值，ODt表示絮凝时间为t时C.vulgaris的OD值。

1.2.3单因素试验当絮凝时间为15 min、初始OD680为0.95时，设定PAC质量浓度为0、10、20、30、40、50、60、70和80 mg·L-1；当絮凝时间为15 min、PAC质量浓度为60 mg·L-1时，设定C.vulgaris初始OD值为0.1、0.5、1、1.5、2、2.5和3；当初始OD680为1.97、PAC质量浓度为60 mg·L-1时，设定絮凝时间为0、5、10、15、20、25和30 min；通过单因素试验研究其对C.vulgaris絮凝效率的影响。

1.2.4响应面分析试验在单因素试验的基础上，进一步利用Box-Behnken中心组合试验设计优化影响PAC絮凝C.vulgaris的3个工艺参数，即PAC浓度(X1)、C.vulgaris初始OD值(X2)、絮凝时间(X3)，并以-1、0、+1代表其水平(表1)。

采用Design Expert 8.0.5.0软件对数据进行回归分析，获得各因素一次效应、二次效应及其交互效应的关联方程，并对PAC絮凝C.vulgaris的工艺条件进行优化。

表1PAC絮凝C.vulgaris工艺的Box-Behnken试验因素水平设计

Table 1Factors and levels for Box-Behnken experimental design on PAC flocculation ofC.vulgaris

2　结果与分析

2.1单因素试验

首先研究PAC质量浓度、C.vulgaris初始OD值及絮凝时间对C.vulgaris絮凝效率的影响，结果如图1、2、3所示。由图1可知，随着絮凝剂PAC浓度的增加，C.vulgaris的絮凝效率逐渐递增，这是由于带正电荷的PAC不断中和微藻细胞表面所带的负电荷，减少了细胞间的静电排斥作用，使其絮凝[14]。此外，PAC的网捕沉淀作用和吸附架桥作用也进一步促进微藻的絮凝沉降[15]。当PAC质量浓度达到60 mg·L-1以后，絮凝效率基本不变。因此，考虑到生产成本以及下游处理的简便性，在进行响应面分析时，选择50、60和70 mg·L-1作为优化PAC质量浓度的3个水平。由图2可知，随着C.vulgaris初始OD值的增大，其絮凝效率不断上升，但当初始OD值大于1.5时，其絮凝效率基本稳定。此外，研究发现：当C.vulgaris的初始OD值处于低水平时，其絮凝效率极低，这可能是由于絮凝剂在藻细胞碰撞成团的过程中作用减弱；也可能是由于藻细胞所带电荷不足以中和絮凝剂所带电荷，因而产生了排斥作用，这与曲孟等人[13]的观点一致。因此在进行响应面分析时C.vulgaris初始OD值选择1.5、2和2.5三个水平。由图3可知，前15 min絮凝效率随絮凝时间的延长而显著增加，可达到75%左右，15 min以后絮凝效率的增长变得缓慢。理论上来说，随着絮凝时间的增加，C.vulgaris细胞和PAC之间的接触越来越充分，絮凝效率会更高，但过长时间的絮凝可能会导致C.vulgaris细胞活性的改变，增加下游处理难度[13,16]。此外，考虑到采收周期成本，在进行响应面分析时，絮凝时间选择10、15、20 min 3个水平。

2.2响应面分析

2.2.1Box-Behnken中心组合优化在单因素试验的基础上，本研究进一步采用3因素3水平的响应面法优化PAC絮凝C.vulgaris的工艺参数，结果见表2。此次Box-Behnken试验设计方案共有17个试验点，其中12个为析因试验，其余5个为中心试验。析因点为自变量取值在X1、X2、X3构成的三维顶点，零点区域为中心点，零点区域重复5次，用于估计试验误差[17]。

表2PAC絮凝普通小球藻(Chlorellavulgaris)工艺的响应面试验设计方案及结果

Table 2Design and results of response surface experiment on PAC flocculation ofC.vulgaris

2.2.2回归方程的建立与检验利用Design Expert 8.0.5.0分析软件对表2中的试验数据进行回归分析，得到C.vulgaris絮凝效率对PAC质量浓度(X1)、C.vulgaris初始OD值(X2)、絮凝时间(X3)3个因素的二次多项回归方程：

表3PAC絮凝C.vulgaris工艺条件优化的回归方程的方差分析及其系数显著性检验

Table 3Variance analysis and significance test on regression equation of response surface experiment for optimizing PAC flocculatingC.vulgaris

注: * 表示有显著性差异(P<0. 05)；** 表示有极显著性差异(P<0. 01)。

2.2.3C.vulgaris絮凝因素间的交互作用分析用Design Expert 8.0.5.0软件根据回归方程进行绘图分析，得到响应面图4～6。图4显示当PAC质量浓度为60 mg·L-1时，絮凝时间与C.vulgaris初始OD值间的交互作用对C.vulgaris絮凝效率的影响，这2个因素的交互作用不显著，随着絮凝时间和C.vulgaris初始OD值的增加，絮凝效率先逐渐上升，然后略有下降，表明适当的增加絮凝时间和C.vulgaris初始OD值可有效提高C.vulgaris的絮凝效率。图5表明当C.vulgaris初始OD值为2时，PAC质量浓度和絮凝时间对C.vulgaris絮凝效率的交互作用不显著，当PAC质量浓度一定时，随絮凝时间的增加，C.vulgaris絮凝效率缓慢上升；而当絮凝时间一定时，随PAC质量浓度的增加絮凝效率先逐渐上升，然后缓慢下降。同时可以看出当PAC质量浓度为中水平，絮凝时间为高水平时，C.vulgaris的絮凝效率处于高水平。图6显示当絮凝时间为15 min时，PAC质量浓度和C.vulgaris初始OD值的交互作用极显著，且在二者均处于中水平时，C.vulgaris絮凝效率最高。

2.2.4最佳工艺条件确定根据Box-Behnken分析模型得知，PAC絮凝C.vulgaris的最佳工艺条件为：PAC质量浓度为56.91 mg·L-1，C.vulgaris初始OD值为2.06，絮凝时间为18.76 min。在此工艺条件下，所得C.vulgaris絮凝效率的理论值为97.51%。为检验响应面法所得最优工艺的可靠性，同时考虑实际操作情况，将PAC絮凝C.vulgaris的最佳工艺条件修正为PAC质量浓度为57 mg·L-1，C.vulgaris初始OD值为2.06，絮凝时间为18 min，实际测得小球藻絮凝效率为95.82%，与理论预测值间误差为1.73%(<5%)。

3　结　论

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(责任编辑：黄爱萍)

Optimization ofChlorellavulgarisFlocculation Using Response Surface Methodology

MA Zhi-xin, HU Xiao-li, CHENG Jie, GAO Kun, DENG Xiang-yuan*

(CollegeofBiotechnology,JiangsuUniversityofScienceandTechnology,Zhenjiang,Jiangsu212018,China)

Flocculation ofChlorellavulgarisusing Poly aluminum chloride (PAC) was optimized by theresponse surface methodology. The factors that affected the flocculation efficiency were in the order flocculation duration>initial OD value ofC.vulgaris>PAC concentration. The optimized flocculation conditions included a PAC concentration of 57 mg·L-1, an initial OD value ofC.vulgarisof 2.06, and flocculation for 18 min to achieve a maximized efficiency of 95.82%.

Chlorellavulgaris; Poly aluminum chloride; flocculation; response surface methodology

2016-03-20初稿；2016-05-09修改稿

马志欣(1994-)，男，主要从事微藻生物制品研究(E-mail: 969080860@qq.com)

邓祥元(1982-)，副教授，博士，主要从事微藻生物学研究(E-mail：dengxy2009@just.edu.cn)

国家自然科学基金(31200381)；江苏省自然科学基金(BK2011493)

S 216.2

A

1008-0384(2016)07-765-06

马志欣，胡小丽，成婕，等.应用响应面法优化普通小球藻的絮凝工艺[J].福建农业学报，2016，31(7)：765-769.

MA Z-X，HU X-L，CHENG J，et al.Optimization ofChlorellavulgarisFlocculation Using Response Surface Methodology[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：765-769.