川芎嗪对内毒素性休克大鼠脑损伤的作用

赵红领， 李 磊， 苗 成

(河南省新乡市中心医院神经内科， 河南 新乡 453000)



川芎嗪对内毒素性休克大鼠脑损伤的作用

赵红领△， 李 磊， 苗 成

(河南省新乡市中心医院神经内科， 河南 新乡 453000)

目的： 研究川芎嗪(ligustrazine，Lig)对内毒素性休克大鼠脑损伤的作用并探讨其作用机制。方法: 将48只健康Wistar大鼠随机分为正常组、LPS组和LPS+Lig组，每组16只，上述每组再分为2个亚组：6 h组和12 h组，各8只大鼠。以尾静脉注射5 mg/kg脂多糖(LPS)建立内毒素性休克大鼠模型， 腹腔注射盐酸川芎嗪注射液200 mg/kg，分别在相应时点进行眼球摘除采血并断头取脑组织，ELISA法检测血清中神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)含量，脑组织匀浆检测一氧化氮(nitric oxide，NO)含量，TUNEL染色法检测脑组织中海马区细胞凋亡情况，Western blot法检测Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果: 与LPS组相比，川芎嗪能降低内毒素性休克所致大鼠NSE和NO含量的上升，同时抑制海马区细胞的凋亡，增加Bax的蛋白表达并降低Bcl-2的蛋白表达。结论: 川芎嗪通过降低NSE和NO含量，减轻内毒素性休克大鼠的脑损伤程度，可能与其调节Bax和Bcl-2蛋白的表达有关。

川芎嗪； 感染性休克； 脑损伤； 神经元特异性烯醇化酶； 一氧化氮

感染性休克又称脓毒性休克(septic shock，SS)，病人由于感染和细菌毒素的全身性作用出现微循坏功能障碍、代谢紊乱和多器官功能衰竭[1]，死亡率高达40%～70%[2]。感染性休克发生时，由于脑组织缺氧很容易出现神经功能障碍和结构受损。一氧化氮(nitric oxide, NO)在哺乳动物脑组织中大量存在，是一种重要的神经递质，具有调节心脑血管与免疫的重要作用。脑损伤会导致内源性NO过量产生，进而大量生成氧自由基，进一步加重脑损伤的情况[3]。神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)在脑损伤时通过血脑屏障释放到血液中，可以作为检测脑损伤和预后的一个敏感指标[4]。

川芎嗪(ligustrazine，Lig)是从中药川芎根茎中提取分离的吡嗪类生物碱，主要成为是四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)。最近研究表明TMP是一种新型的钙离子拮抗剂与自由基清除剂，可透过血脑屏障，改善微循环，具有抗炎抗氧化以及保护神经的作用[5]。报道[6]指出盐酸川芎嗪以80 mg/kg体重腹腔注射大鼠，可透过血脑屏障到达脑组织，直接发挥作用。国内学者系统性评价了川芎嗪注射液对缺血性脑卒中急性期的临床治疗效果，Meta分析结果显示川芎嗪注射液能安全有效地改善缺血性中风急性期患者的神经功能缺损的情况[7]。目前尚未有报道对川芎嗪是否可用于感染性休克脑损伤的治疗，本研究拟通过注射大剂量内毒素/细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)建立模拟感染性休克病理过程的内毒素性休克大鼠模型，探讨川芎嗪对感染性休克大鼠脑损伤的作用及其初步机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物与试剂

健康1月龄Wistar大鼠48只，体重(160±10)g，由河南大学动物中心提供。动物自由饮食，饲养于温度(22±2)℃、平均湿度(55±5)%、12 h明暗交替的条件下。

盐酸川芎嗪注射液(2%)购自郑州卓峰制药厂；LPS(E.coliO55:B5)购自Sigma； NO测定试剂盒和NSE测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；抗Bax、Bcl-2与GAPDH抗体购自Santa Cruz。

2 实验方法

2.1 动物模型的建立与分组 参考Ikejima等[8]与万芳等[9]的方法建立内毒素性休克大鼠模型，用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射，动物麻醉成功后仰卧固定，酒精消毒颈部皮肤，颈部正中开2 cm切口，游离出右侧颈总动脉，动脉夹夹闭近心端，用置留针穿刺颈总动脉，松开动脉夹，用5-0号线固定置留针，导管外接三通与HP监护仪连接，检测生命体征，尾静脉推注LPS 5 mg/kg，当血压降低为原始值的2/3(约40 mmHg)，并维持2～3 h以上，伴有皮肤发绀、躁动、少尿(将大鼠置于代谢笼中观察尿量)等现象，提示内毒素性休克动物模型制备成功。

实验按随机原则分为正常对照(control)组、LPS组和LPS+Lig组，每组16只大鼠。每组再分为6 h组与12 h组2个亚组，每组8只大鼠，分别在给药后6 h和12 h后眼球摘除取血及断头处死取脑组织。其中正常组大鼠用相同剂量的生理盐水代替LPS和盐酸川芎嗪注射液。造模成功后LPS+Lig组的大鼠腹腔注射盐酸川芎嗪注射液200 mg/kg，LPS组的大鼠腹腔注射相同剂量的生理盐水。

2.2 ELISA法检测血清中NSE含量水平 摘取眼球采血后，4 000 r/min离心10 min，取上清液，取包被抗NSE特异性抗体的酶标版，每孔加入0.1 mL标准品或待测血清，37 ℃孵育1 h，洗涤，加入0.1 mL生物素化抗大鼠NSE蛋白抗体，37 ℃孵育1 h，洗涤，加入0.1 mL辣根过氧化酶标记的抗生素蛋白链菌素，37 ℃孵育30 min，洗涤，轻轻吸干水分，每孔加入0.1 mL四甲基联苯胺(TMB)显色液，37 ℃孵育10 min，加入0.1 mL终止液，于波长为450 nm处测定吸光度(A)值，计算血清中NSE的含量。

2.4 TUNEL染色法 制作脑组织石蜡切片，二甲苯浸泡5 min，梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)洗涤，蛋白酶K工作液处理20 min，洗涤，轻轻擦干水分，加入TUNEL反应混合液20 μL，37 ℃湿盒放置60 min，洗涤，擦干水分，3%过氧化氢37 ℃封闭10 min，加入50 μL 过氧化酶，盖上盖玻片，37 ℃湿盒放置30 min，洗涤，DAB染色，洗涤，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，封片，光学显微镜下计数。随机选取3个视野，观察海马区凋亡细胞数。

2.5 Western blot 实验 取各组细胞弃去培养液，洗涤，加入裂解液，置于冰上裂解30 min，离心，提取细胞蛋白并定量。取适量裂解产物，以1∶4比例加入样品与缓冲液，进行SDS-PAGE，电泳完成后转移至硝酸纤维素膜上，脱脂牛奶室温封闭1 h，加入相应I抗(1∶50)4 ℃孵育4 h，TBST洗涤20 min；加入相应II抗(1∶200)室温孵育1 h，TBST洗涤20 min；显色，成像扫描分析系统保存图像并分析数据。

3 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件进行数据分析，所有实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间的差异检验用单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t检验分析各组均数间的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 血清中NSE含量水平的变化

实验结果显示，在2个时点处，LPS组大鼠血清中NSE含量显著高于正常组(P<0.05)，LPS+Lig组大鼠血清中NSE的含量显著低于LPS组(P<0.05)，但仍高于control组的水平，12 h组的NSE含量下降程度比6 h组更大，见表1。

2 脑组织中NO含量水平的变化

实验结果显示，在2个时点处，LPS组大鼠脑组织中NO含量显著高于control组(P<0.05)，LPS+Lig组大鼠脑组织中NO含量显著低于LPS组(P<0.05)，但仍高于control组的水平，12 h组的NSE含量下降程度比6 h组更大，见表2。

表1 6 h和12 h各组大鼠血清中NSE含量水平的变化

Table 1.The changes of NSE levels in the serum at 6 h and 12 h after injection of LPS (mg/L.Mean±SD.n=8)

Group6h12hControl24.53±2.1325.81±2.47LPS47.53±2.77*56.91±3.43*LPS+Lig36.65±2.51*#40.41±3.17*#

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

表2 6 h和12 h各组大鼠脑组织中NO含量水平的变化

Table 2.The changes of NO levels in the brain at 6 h and 12 h after injection of LPS (μmol/g. Mean±SD.n=8)

Group6h12hControl2.47±0.282.67±0.25LPS5.05±0.23*6.91±0.41*&LPS+Lig3.62±0.21*#4.07±0.27*#&

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS；&P<0.05vs6 h.

3 脑组织海马区细胞凋亡情况的变化

TUNEL染色结果显示，与control组大鼠脑组织中海马区凋亡细胞数量相比， LPS组大鼠脑组织海马区中凋亡阳性细胞的数量较多，尤其12 h更为显著；LPS+Lig组大鼠脑组织海马区的凋亡阳性细胞数量显著少于LPS组，见图1。

Figure 1.The representative images of TUNEL staining and statistical analysis of the cell apoptosis (×200).Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS;&P<0.05vs6 h.

图1 TUNEL染色检测凋亡细胞情况

4 Bax和Bcl-2蛋白表达的变化

与control组相比，LPS组大鼠脑细胞中的Bcl-2蛋白表达显著下降(P<0.05)，Bax的蛋白表达显著上升(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+Lig组大鼠脑细胞中Bcl-2的蛋白表达显著上升(P<0.05)，Bax的蛋白表达显著下降(P<0.05)，见图2。

Figure 2.The representative images of Western blot and statistical analysis of Bax and Bcl-2 expression in the brain at 6 h and 12 h after injection of LPS. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS;&P<0.05vs6 h.

图2 6 h与12 h时各组大鼠脑细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达的变化

讨 论

感染性休克对机体各个脏器均有不同程度的损伤，由于脑组织氧贮备量最小，因此在感染性休克时最容易受损。一氧化氮(NO)是一种反应极强的自由基，当内毒素刺激星形胶质细胞，iNOS活性升高，NO含量增加[10]，脑组织缺血缺氧大量释放谷氨酸，激活NMDA，Ca2+增加，Ca2+与钙调蛋白结合激活NOS，使内源性NO过量产生和释放，促使氧自由基大量产生，进一步加重脑损伤[11]。本实验结果表明感染性休克大鼠脑组织中NO含量显著升高，提示NO可能参与了感染性休克导致脑损伤的发病进展过程，给予川芎嗪干预后，大鼠脑组织中NO含量显著减少，提示川芎嗪可能是通过抑制NO产生来缓解大鼠脑损伤的情况。研究指出血清中NSE含量的变化具有提示早期脑缺血缺氧后神经元损伤，可作为神经保护药物疗效的评价指标之一[12]。本研究结果表明川芎嗪能够下调感染性休克大鼠血清中NSE含量的升高，提示川芎嗪可能具有保护神经的作用。

脑细胞的损伤常与细胞凋亡相关，TUNEL染色结果显示LPS组脑细胞凋亡数显著高于control组，给予川芎嗪干预后细胞凋亡数则明显降低，提示川芎嗪可能通过减少细胞凋亡，改善脑损伤程度并具有神经保护的作用。Bcl-2家族在调控细胞凋亡的过程中起非常重要的作用，Bcl-2作为抗凋亡蛋白，对细胞具有保护作用；Bax是促凋亡蛋白。我们研究发现给予川芎嗪干预后，抑制内毒素性休克大鼠脑组织中Bax蛋白表达的上调与Bcl-2蛋白表达的下调，提示川芎嗪可能通过调节Bcl-2与Bax蛋白表达抑制感染性休克时脑细胞的凋亡，对中枢神经元具有保护作用。

本实验为川芎嗪在感染性休克脑损伤的治疗提供了一定的实验基础与新的思路，还需更进一步的实验研究与临床推广。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Effect of ligustrazine on cerebral injury in LPS-induced septic shock rats

ZHAO Hong-ling, LI Lei， MIAO Cheng

(DepartmentofNeurology,XinxiangCentralHospital,Xinxiang453000,China.E-mail:honglingzhao69@163.com)

AIM: To investigate the effect of ligustrazine (Lig) on cerebral injury in LPS-induced septic shock rats and to explore the underlying mechanism.METHODS: Wistar rats (n=48) were randomly divided into control group, LPS group and LPS+Lig treatment group. The rats in LPS group were randomly divided into 2 subgroups at time points of 6 h and 12 h. After ligustrazine treatment, the venous blood was collected by removal of eyeballs to detect the concentration of neuron-specific enolase (NSE) using ELISA. The nitric oxide (NO) concentration in the homogenate of brain tissues was examined. The apoptosis in the hippocampus was analyzed by TUNEL staining. The protein expression of Bax and Bcl-2 was determined by Western blot.RESULTS: Ligustrazine inhibited the elevation of NSE and NO concentrations in LPS-induced septic shock rats. Furthermore, ligustrazine administration also attenuated LPS-induced increase in Bax expression and decrease in Bcl-2 expression. CONCLUSION: Ligustrazine decreases the concentration of NSE and NO, and attenuates cerebral injury in LPS-induced septic shock rats. These effects may be related to the regulation of Bax and Bcl-2 expression.

Ligustrazine; Septic shock; Cerebral injury; Neuron-specific enolase; Nitric oxide

杂志网址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1708- 05

2016- 05- 11

2016- 07- 07

△通讯作者 Tel: 0373-2048935； E-mail: honglingzhao69@163.com

R515.3； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.030