利拉鲁肽通过调节microRNA-375对胰岛细胞凋亡的影响

杨庆宇， 郜 娜

(1郑州人民医院药学部， 2郑州大学附属肿瘤医院， 河南省肿瘤医院药学部，河南 郑州 450053)



利拉鲁肽通过调节microRNA-375对胰岛细胞凋亡的影响

杨庆宇1△， 郜 娜2

(1郑州人民医院药学部，2郑州大学附属肿瘤医院， 河南省肿瘤医院药学部，河南 郑州 450053)

目的： 观察利拉鲁肽通过微小RNA-375(microRNA-375，miR-375)对db/db小鼠胰岛细胞凋亡的影响，探讨其可能作用机制，为临床应用提供药效学依据。方法: 20只8周龄雄性db/m小鼠为正常对照组，皮下注射等量的生理盐水。40只8周龄雄性db/db小鼠随机分为2组，每组20只：糖尿病对照组的db/db小鼠皮下注射等量生理盐水；利拉鲁肽组的db/db小鼠皮下注射利拉鲁肽300 μg·kg-1·d-1。给药8周后，检测各组小鼠体重(BW)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量，并进行腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)和胰岛素耐量实验(ITT)；苏木精-伊红(HE)染色检测胰岛组织病理学变化；原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测胰岛凋亡情况；Western blot法检测胰岛凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2及Bax的蛋白水平；实时荧光定量PCR检测胰岛miR-375的表达水平。小鼠胰岛β细胞系MIN-6分为对照组(等量溶媒孵育)、miRNA-375 mimic组和miRNA-375 mimic+利拉鲁肽组，MTT实验检测细胞活力，Western blot法检测各组细胞caspase-3、 Bcl-2及Bax的蛋白水平。结果: 整体实验中，与对照组相比，利拉鲁肽组BW、FBG、FINS、TC、TG及LDL-C含量明显降低(P<0.05)；胰岛数量较模型组增多，体积较大，细胞结构明显改善；胰岛细胞凋亡减少；利拉鲁肽组的Bcl-2表达明显增高，caspase-3和Bax的表达显著下降(P<0.05)；胰岛组织miR-375的水平显著降低(P<0.01)。细胞实验中，经miRNA-375 mimic处理24 h后，MIN-6细胞活力显著降低，Bcl-2表达减少，而caspase-3和Bax的蛋白水平显著增加(P<0.05)，给予利拉鲁肽组治疗后，MIN-6细胞活力明显上升，Bcl-2表达明显增高，caspase-3和Bax的蛋白水平显著下降(P<0.05)。结论: 利拉鲁肽可以抑制糖尿病胰岛β细胞的凋亡，其机制可能与调控胰岛组织中miR-375的表达有关。

利拉鲁肽； MicroRNA-375； 胰岛细胞； 细胞凋亡

2型糖尿病主要由胰岛素抵抗和β细胞功能障碍导致的绝对或相对的胰岛素分泌不足而引起[1]。对于2型糖尿病而言，β细胞功能障碍是导致胰岛素分泌不足的主要原因，而细胞凋亡是导致胰岛β细胞功能障碍的关键因素，所以抑制胰岛β细胞的过度凋亡，维持胰岛细胞再生和死亡的平衡，是糖尿病治疗的关键要素[2]。微小RNAs(microRNAs，miRNAs，miR)调节正常的细胞分化、细胞增殖和凋亡，研究发现miRNAs在胰腺发育和功能的维持中起着非常重要的作用， miR-375是在胰腺中特异表达的microRNAs之一，它的正常表达与否对胰腺的形态、发育和功能也至关重要[3]。研究表明，胰岛细胞中miR-375低表达或表达缺失可通过减少β细胞团而减少胰岛素的分泌，相反miR-375过表达将会影响胰岛β细胞功能，同样减少胰岛素的分泌[4]。梁国威等[5]和胥娟等[6]研究结果亦显示，2型糖尿病患者血清中的miR-375水平显著高于正常对照组。夏华强[7]研究证实miR-375过表达可以通过抑制MTPN的表达引起胰腺损伤。由此可见，维持miR-375正常表达可能成为糖尿病治疗的新靶点。

利拉鲁肽(liraglutide)作为一种新型抗糖尿病药物，是长效人胰高糖素样肽-1(glucagons-like peptide-1，GLP-1)类似物，已广泛应用于临床，其主要以葡萄糖浓度依赖的模式刺激胰岛素的分泌，从而安全有效降低糖尿病患者血糖，然而，近年来，研究者对利拉鲁肽研究显示，其作用机制不仅局限于这一点。胥娟等[6]研究结果显示利拉鲁肽治疗初诊断2型糖尿病后，胰岛β细胞功能的改善可能与血清中miR-375表达下调有关。王允山等[8]研究显示利拉鲁肽治疗db/db小鼠8周后胰岛形态显著改善，β细胞增殖活跃，同时与模型对照组相比，给药组miR-375表达降低了50%。以上研究表明，利拉鲁肽对胰岛细胞有保护作用且与miR-375有关，但利拉鲁肽对通过miR-375对胰岛的保护作用是否通过抑制胰岛细胞凋亡并没有明确研究报道。因此，本实验在db/db小鼠模型及MIN-6细胞系上研究miR-375与胰岛细胞凋亡的关系，以及利拉鲁肽是否通过miR-375抑制胰岛细胞凋亡。

材 料 和 方 法

1 实验动物和细胞

40只8周龄雄性db/db小鼠，购自江苏省动物实验基地南京军区总医院实验动物中心[合格证号SCXK(苏)2012-450]，体重25～35 g；20只8周龄雄性db/m小鼠，体重30～40 g，购自江苏省动物实验基地南京军区总医院实验动物中心[合格证号SCXK(苏)2012-450]。MIN-6细胞系购自ATCC。

2 试剂和仪器

利拉鲁肽购自诺和诺德制药有限公司，国药准字J20110026；血糖试剂及血糖仪购自Roche；血糖、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)及低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒生产于碧云天生物技术公司； I 抗GAPDH、Bcl-2、Bax、caspase-3及 II 抗购自CST;TRIzol、RNA to cDNA EcoDryTMPremix、XfectTMMicroRNA Transfection Reagent、Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR® Kit、miR-375、miR-375 mimic及U6引物购自TaKaTa生物工程有限公司； DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco；胰酶购自Sigma。

低温超速离心机(Thermo)；Western blot电泳系统(Bio-Rad)；凝胶成像系统(Tanon)；光学显微镜(OLYMPUS)；分析天平(METTLER TOLEDO)；细胞培养箱(SANYO)。

3 方法

3.1 动物分组、模型复制及给药 所有小鼠饲养于清洁级环境中，保持湿度55%～65%，温度25 ℃，并且维持12/12 h明暗交替。20只db/m小鼠作为正常对照组，皮下注射等量的生理盐水； 40只db/db小鼠随机分为2组：糖尿病对照组，db/db小鼠皮下注射等量的生理盐水；利拉鲁肽组，db/db小鼠皮下注射利拉鲁肽300 μg·kg-1·d-1。给药8周后，摘眼球取血，3 500 r/min离心15 min，吸取上清保存于-80 ℃冰箱中待用。分离胰岛，一部分保存于-80 ℃冰箱，一部分固定于10%的甲醛溶液中待用。

3.2 糖脂代谢指标的测定 每周监测体重和血糖，给药前和给药后测定体重(body weight，BW),空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)和血胰岛素(fasting blood insulin， FINS)水平，空腹总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)及LDL-C含量。

3.3 腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT) 给药8周后，小鼠禁食12 h，腹腔注射20%葡萄糖，剂量为1 g/kg体重，分别于0 、30、60、90和120 min眼眶静脉采血，测定血糖、胰岛素水平。4 ℃ 3 500 r/min离心15 min，吸取上清保存于-80 ℃冰箱中待用。

3.4 胰岛素耐量实验(insulin tolerance test，ITT) 小鼠禁食4 h，腹腔注射生物合成人胰岛素，剂量为2 U/kg，分别于0、15、30和60 min尾尖采血测血糖，并将每个时点的血糖值与0 min血糖值比较，以血糖降低的幅度反映胰岛素的敏感性。

3.5 苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色 将固定于10%甲醛中的胰岛脱水后常规石蜡包埋，切片。将切片二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，伊红染色，苏木精复染，梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂胶封片。光镜下观察，进行病理学分析。

3.6 原位末端转移酶标记实验(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL) 将固定于10%甲醛中的胰岛常规石蜡包埋，切片。之后将切片二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、20 mL/L蛋白酶K 37 ℃孵育30 min、0.3% H2O2的甲醇液室温孵育5 min、滴加50 μL TUNEL反应混合液于暗室内37 ℃孵育60 min、滴加50 μL POD转换液于暗室内37 ℃孵育30 min、DAB显色、苏木精复染、盐酸乙醇分化、自来水冲洗、梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂胶封固、镜下观察。

3.7 细胞培养 小鼠胰岛β细胞系MIN-6培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(含1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素)，孵育于温度37 ℃、湿度90%、含5% CO2的细胞培养箱中，待细胞生长至70%～80% 覆盖，用0.25%胰酶消化细胞进行传代。MIN-6分为对照组(等量溶媒孵育)、miRNA-375 mimic(50 nmol/L)组和miRNA-375 mimic+利拉鲁肽(100 nmol/L)组，转染6 h后去除转让媒介继续孵育18 h后，采用MTT方法检测细胞活力，另用冰PBS清洗后收集总蛋白。

3.8 MTT实验检测细胞活力 MIN-6细胞经药物处理24 h后，每孔加入20 μL 5 g/L MTT溶液，继续培养4 h，小心吸取上清液，加入200 μL DMSO，充分振荡使甲臜完全溶解，490 nm下测定吸光度(A)，计算细胞存活率，达到90%以上即认为此浓度对细胞活力无明显影响。

3.9 Western blot法检测凋亡相关蛋白水平 提取胰岛组织或细胞蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白含量并稀释样本，配制5%浓缩胶和12%或15%分离胶，上样，电泳，将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，并于5%脱脂奶粉或5% BSA封闭液中室温下封闭2 h，洗膜，加 I 抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)，4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜，加II抗(1∶ 5 000)室温孵育2 h，洗膜，采用ECL化学发光法显色，使用Quantity One软件对结果进行处理分析。

3.10 Real-time PCR检测胰岛中的miR-375水平 采用TRIzol两步法抽提小鼠胰岛总RNA，并按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录。反应体系(20 μL)：总 RNA 50 ng；GSP(RT-primer) 2 μL，1 pmol；2×TS Reaction Mix 10 μL；Transcript RT/RI Enzyme Mix 1 μL；RNase-free water 加至 20 μL。反应条件 为42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min，所得cDNA于-20 ℃保存备用。采用real-time PCR 检测胰岛中 miR-375含量，以U6作为内参照。反应体系(20 μL):SYBR Green Mix 9 μL，RT-Product 2 μL，正义引物0.8 μL，反义引物0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。扩增后miRNA的表达量计算公式为2-ΔΔCt。

4 统计学处理

使用SPSS 17.0软件进行数据统计。计量资料均以均数±标准误(mean±SEM)表示，组间比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠糖脂代谢指标的变化

8周龄时，db/db小鼠的空腹血糖均已超过15 mmol/L，符合糖尿病小鼠高血糖代谢特征。基线水平时，糖尿病对照组和利拉鲁肽组小鼠的BW、FBG、TC、TG和LDL-C均无明显差异，但明显高于非糖尿病组。利拉鲁肽组小鼠在给药8周后，与给药前相比血糖没有进一步的发展，且显著低于糖尿病对照组(P<0.05)。给药8周后FBG、TC、TG和LDL-C显著低于糖尿病对照组(P<0.05)，BW高于糖尿病对照组(P<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠血清生化指标的比较

*P<0.05,**P<0.01vsdiabetic group.

2 IPGTT结果

糖尿病对照组、利拉鲁肽组小鼠血糖均在给予葡萄糖30 min后达到峰值，随后下降。与糖尿病对照组比较，利拉鲁肽组小鼠血糖水平显著下降(P<0.01)，血糖曲线下面积计算结果亦显示利拉鲁肽组明显低于糖尿病对照组(P<0.05)。糖尿病对照组小鼠腹腔注射葡萄糖引起的胰岛素释放显著受损，胰岛素释放曲线低平，没有明显的分泌高峰，利拉鲁肽组较糖尿病对照组胰岛素分泌得到明显改善，在30 min出现高峰，达到基线值的1.9倍，胰岛素曲线下面积增加2.1倍(P<0.01)，见图1。

Figure 1.The curves of blood glucose concentrationvstime (A) and their area under the curve (B) and the curves of insulin concentrationvstime (C) and their area under the curve (D) in intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT). Mean±SEM.n=20.*P<0.05,**P<0.01vsdiabetic group.

图1 腹腔注射葡萄糖耐量实验中血糖和胰岛素随时间变化曲线及其曲线下面积

3 ITT结果

与糖尿病对照组比较，利拉鲁肽组小鼠胰岛素敏感性明显增加，ITT各个时点血糖降低幅度均明显增加(P<0.05)，见图2。

4 各组小鼠胰岛的形态学观察

经HE染色，显微镜下观察可见：正常对照组小鼠胰岛较大，胰岛细胞数量较多，大小一致，排列整齐，分布均匀；糖尿病对照组小鼠胰岛数目明显减少，形状不规则，排列紊乱，分布稀疏，出现空泡区；利拉鲁肽组小鼠胰岛数量较糖尿病对照组增多，体积较大，细胞结构明显改善，见图3。

5 各组小鼠胰岛的TUNEL染色观察

经TUNEL染色后，显微镜下观察判断标准为正常细胞核呈淡蓝色，阳性细胞核出现深棕色颗粒。结果显示正常对照组小鼠胰岛细胞排列整齐，无棕色阳性细胞；糖尿病对照组胰岛细胞排列松散，并有大量棕色阳性细胞；利拉鲁肽组较糖尿病对照组棕色阳性细胞明显减少，见图4。

Figure 2.Percentage changes of glucose concentration at initial in insulin tolerance test (ITT). Mean±SEM.n=20.*P<0.05,**P<0.01vsdiabetic group.

图2 胰岛素耐量实验中腹腔注射胰岛素后血糖随时间的变化曲线

Figure 3.The histopathological examination of the islet in each group (×400).

图3 各组小鼠胰岛的病理学检查

Figure 4.TUNEL staining of islet in each group (×400).

图4 小鼠胰岛的TUNEL染色

6 各组小鼠胰岛组织凋亡相关蛋白的表达

与糖尿病对照组相比，利拉鲁肽组小鼠胰岛组织凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达明显升高，凋亡相关蛋白Bax的表达水平明显降低，caspase-3剪切水平明显降低，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图5。

7 各组小鼠胰岛组织miR-375水平的观察

与正常对照组相比，糖尿病对照组小鼠胰岛组织中miR-375含量显著升高(P<0.01)；与糖尿病对照组比较，利拉鲁肽组小鼠胰岛组织中miR-375含量明显降低(P<0.01)，见图6。

8 利拉鲁肽对miR-375过表达的MIN-6细胞活力的影响

如图7所示，小鼠胰岛β细胞系MIN-6经miR-375 mimic孵育12 h后，细胞活力显著降低，为溶媒对照组的70%(P<0.01)；与miR-375 mimic组相比，共孵育利拉鲁肽组的细胞活力显著增加(P<0.01)。

9 利拉鲁肽对miR-375过表达的MIN-6细胞凋亡相关蛋白的影响

如图8所示，经miRNA-375 mimic处理12 h后，MIN-6细胞活力显著降低，Bcl-2表达减少，而caspase-3和Bax的蛋白水平显著增加(P<0.05)，共孵育利拉鲁肽后，Bcl-2表达明显增高，caspase-3和Bax的蛋白水平显著下降(P<0.05)。

Figure 5.Apoptosis-related protein levels in the islet of each group. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsdiabetic group.

图5 小鼠胰岛中凋亡相关蛋白水平的检测

Figure 6.miR-375 levels in the islet of each group. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsdiabetic group.

图6 小鼠胰岛miR-375含量的观察

讨 论

2型糖尿病以胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能衰竭为特征[9]。在糖尿病发病初期，胰岛β细胞分泌功能代偿性增强，表现为胰岛素抵抗和高胰岛素血症。随着病程的发展，胰岛β细胞功能代偿逐渐衰退，出现胰岛β细胞功能衰竭和细胞凋亡，进一步加重糖尿病的代谢紊乱，并导致一系列并发症。因此，胰岛β细胞的功能衰退是2型糖尿病发展过程中的关键环节，如何保护和防止胰岛β细胞功能衰竭和细胞凋亡是目前2型糖尿病防治的关键之一[10]。

Figure 7.The viability of the MIN-6 cell with different treatments. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsmiR-375 group.

图7 各组MIN-6细胞活力的比较

Figure 8.Apoptosis-related protein levels in the MIN-6 cells with different treatments. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmiR-375 group.

图8 MIN-6细胞凋亡相关蛋白水平的检测

MicroRNA大部分在生物体中呈现特异性表达，可调节生物体的发育、神经分化、细胞增殖、凋亡等。miR-375是在进化中高度保守的microRNA，大量研究表明miR-375是在胰腺中特异表达最多的microRNA之一，在维持胰岛β细胞的增殖、凋亡及胰岛素分泌功能上发挥重要作用[11]。研究发现，miR-375的过度表达可抑制鼠胰岛β细胞中由葡萄糖诱发的胰岛素分泌，相反，内源性miR-375的功能被抑制后则可以促进胰岛素的分泌[12]。另有研究显示，miR-375可加剧棕榈酸诱导的胰岛β细胞凋亡。以上表明miR-375可作为改善胰岛β细胞功能，治疗2型糖尿病的靶点。

利拉鲁肽作为一种新型抗糖尿病药物，已广泛应用于临床。体外研究证实利拉鲁肽可以抑制白细胞介素1β诱导的β细胞凋亡，诱导人胰岛细胞增殖[13]。动物研究发现利拉鲁肽可促进糖尿病小鼠胰岛β细胞增殖[14]，并且利拉鲁肽可以改善边缘胰岛细胞移植小鼠抑制物的植入和功能，使移植后的β细胞凋亡减少[15]。此外，大量的体内外研究均表明，利拉鲁肽可以通过影响自噬保护高血脂及高血糖诱导的胰岛β细胞凋亡，改善胰岛β细胞功能[16-19]。然而，目前均无报道证明利拉鲁肽是否通过调节miR-375进而抑制胰岛β细胞凋亡。

本文主要探讨利拉鲁肽通过调节miR-375抑制胰岛细胞凋亡的作用。整体实验结果显示，利拉鲁肽可以降低db/db小鼠BW、FBG、FINS、TC、TG及LDL-C含量，HE结果显示利拉鲁肽可以改善胰岛结构紊乱，TUNEL结果显示利拉鲁肽可以抑制胰岛细胞凋亡，Western blot实验结果显示Bcl-2表达明显增高，caspase-3和Bax的蛋白水平显著下降；胰岛组织miR-375水平显著降低。进一步在细胞实验中给予MIN-6细胞大剂量的miR-375 mimic孵育后，细胞活力显著下降，且Bcl-2水平显著下降，caspase-3和Bax水平显著增加，直接证明miR-375上调会导致胰岛β细胞凋亡。而利拉鲁肽则可以通过下调或抑制miR-375起到保护胰岛β细胞的作用。

[1] Costes S, Langen R, Gurlo T, et al. β-Cell failure in type 2 diabetes: a case of asking too much of too few?[J]. Diabetes, 2013, 62(2):327-335.

[2] Lorenzo C, Wagenknecht LE, D’Agostino RB Jr, et al. Insulin resistance, beta-cell dysfunction, and conversion to type 2 diabetes in a multiethnic population: the Insulin Resistance Atherosclerosis Study[J]. Diabetes Care, 2010, 33(1):67-72.

[3] Poy MN, Eliasson L, Krutzfeldt J, et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion[J]. Nature, 2004, 432(7014):226-230.

[4] 张延彩, 王 芳, 申虎威. MicroRNAs与胰岛β细胞及2型糖尿病的研究进展[J]. 长治医学院学报, 2015, 29(5):393-396.

[5] 梁国威, 宋 燕, 邵冬华, 等. 初诊2型糖尿病患者血清中miR-29a和miR-375表达变化及其与糖、脂标志物相关性研究[J]. 中国实验诊断学, 2013, 17(3):475-478.

[6] 胥 娟, 王 尧, 唐 伟，等. 利拉鲁肽治疗初诊断2 型糖尿病患者血清miR-375 的表达及胰岛功能的相关分析[J]. 南京医科大学学报：自然科学版， 2015, 35(11):1590-1593.

[7] 夏华强. miR-375过表达引起胰腺损伤的初步研究[D]. 长沙:中南大学， 2008.

[8] 王允山, 张 雅, 梁 浩，等. miRNAs在糖尿病及其并发症中的作用[J]. 生理科学进展, 2010, 41(2):133-136.

[9] Porte D Jr, Kahn SE. β-Cell dysfunction and failure in type 2 diabetes: potential mechanisms[J]. Diabetes, 2001, 50(Suppl 1): S160-S163.

[10]Prentki M, Nolan CJ. Islet beta cell failure in type 2 diabetes[J]. J Clin Invest, 2006, 116 (7):1802-1812.

[11]Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing[J]. Cell, 2007, 129(7):1401-1414.

[12]Poy MN, Hausser J, Trajkovski M, et al. miR-375 maintains normal pancreatic alpha- and beta-cell mass[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(14):5813-5818.

[13]Bregenholt S, Moldrup A, Blume N, et al. The long-ac-ting glucagon-like peptide-1 analogue, liraglutide, inhibits beta-cell apoptosisinvitro[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 330(2):577-584.

[14]Rolin B, Larsen MO, Gotfredsen CF, et al. The long-ac-ting GLP-1 derivative NN2211 ameliorates glycemia and increases beta-cell mass in diabetic mice[J]. Am J Phy-siol Endocrinol Metab, 2002, 283(4):E745-E752.

[15]Merani S, Truong W, Emamaullee JA, et al. Liraglutide, a long-acting human glucagon-like peptide 1 analog, improves glucose homeostasis in marginal mass islet transplantation in mice[J]. Endocrinology, 2008, 149(9):4322-4328.

[16]Wang J, Wu J, Wu H, et al. Liraglutide protects pan-creatic beta-cells against free fatty acidsinvitroand affects glucolipid metabolism in apolipoprotein E-/-mice by activating autophagy[J]. Mol Med Rep, 2015, 12(3):4210-4218.

[17]Tamura K, Minami K, Kudo M, et al. Liraglutide improves pancreatic beta cell mass and function in alloxan-induced diabetic mice[J]. PLoS One, 2015, 10(5):e0126003.

[18]Chen ZF, Li YB, Han JY, et al. Liraglutide prevents high glucose level induced insulinoma cells apoptosis by targeting autophagy[J]. Chin Med J (Engl), 2013, 126(5): 937-941.

[19]Huang C, Yuan L, Cao S. Endogenous GLP-1 as a key self-defense molecule against lipotoxicity in pancreatic islets[J]. Int J Mol Med, 2015, 36(1):173-185.

(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Anti-apoptosis effect of liraglutide on islet via regulating microRNA-375

YANG Qing-yu1, GAO Na2

(1DepartmentofPharmacy,People’sHospitalofZhengzhou,2DepartmentofPharmacy,AffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity,HenanCancerHospital,Zhengzhou450053,China.E-mail:qingyuyang2016@163.com)

AIM: To observe the anti-apoptosis effect of liraglutide on the islet through microRNA-375 (miR-375) for providing additional pharmacodynamic evidence for its clinical application. METHODS: Forinvivostudy, C57BL/KsJ-db/mmice aged 8 weeks served as normal control group. A total of 40 male genetically diabetic C57BL/KsJ-db/dbmice at the same age were randomly divided into diabetic control group (thedb/dbmice were injected subcutaneously with equivalent amount of saline) and liraglutide group (thedb/dbmice were injected subcutaneously with liraglutide at dose of 300 μg·kg-1·d-1). After 8 weeks of administration, body weight (BW) was measured and blood was collected for detection of fasting blood glucose (FBG), fasting blood insulin (FINS), triglyceride (TG), total cholesterol (TC) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C). Before sacrifice, intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) and insulin tolerance test (ITT) were conducted. The histopathological features in the islet tissue were examined with HE staining. The apoptosis in the islet tissue was detected by TUNEL staining. The protein levels of caspase-3, Bcl-2 and Bax were determined by Western blot. The level of miR-375 in the islet tissue was detected by qPCR. Forinvitrostudy, the MIN-6 cells were cultured and divided into control group (incubated with equivalent amount of solvent), miR-375 mimic group and miR-375 mimic+ liraglutide group. The cell viability was examined by MTT assay. The protein levels of caspase-3, Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. RESULTS: In theinvivostudy, compared with control group, the levels of BW, FBG, FINS, TC, TG and LDL-C were decreased significantly in liraglutide group. The islet apoptosis was reduced by the administration of liraglutide. The expression of Bcl-2 was up-regulated significantly, while the protein levels of caspase-3 and Bax were down-regulated significantly in liraglutide group. The level of miR-375 was decreased significantly. In theinvitrostudy, the cell viability was decreased in miR-375 mimic group and increased in miR-375 mimic+liraglutide group. Moreover, the expression of Bcl-2 was decreased and the protein levels of caspase-3 and Bax were increased with the incubation of miR-375 mimic, while the expression of Bcl-2 was increased and the protein levels of caspase-3 and Bax were decreased with the co-incubation of miR-375 mimic and liraglutide. CONCLUSION: Liraglutide attenuates islet apotosis, and the mechanism may be associated with its effects of reducing the elevated level of miR-375 in islet tissues.

Liraglutide; MicroRNA-375; Islet cells; Apoptosis

杂志网址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1627- 08

2016- 03- 16

2016- 08- 11

△通讯作者 Tel: 0371-67077230; E-mail: qingyuyang2016@163.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.016