抗病毒治疗后HIV感染者NKT样细胞衰老和体外增殖研究①

赵　雪　刘婷婷　张子宁　傅雅静　姜拥军

(中国医科大学附属第一医院 卫生部艾滋病免疫学重点实验室，沈阳110001)



抗病毒治疗后HIV感染者NKT样细胞衰老和体外增殖研究①

赵雪刘婷婷张子宁傅雅静姜拥军②

(中国医科大学附属第一医院 卫生部艾滋病免疫学重点实验室，沈阳110001)

目的：研究高效抗逆转录病毒治疗(Highly active antiretroviral therapy，HAART)后NKT样细胞衰老和体外增殖情况。方法：选取未接受HAART治疗、接受HAART治疗的HIV感染者以及健康人的外周血细胞，利用流式细胞仪检测接受HAARRT治疗前后的HIV感染者NKT样细胞CD57的表达情况以及体外增殖能力。结果：HIV感染者在HAART治疗前NKT样细胞的百分数显著低于健康对照组(P<0.01)，HAART治疗后恢复(P<0.05)；HAART治疗前NKT样细胞CD57的表达明显高于健康对照组(P<0.01)，HAART治疗后恢复(P<0.05)；HAART治疗前NKT样细胞体外增殖能力明显 低于健康对照组，HAART治疗后有所恢复。结论：经过HAART治疗后，HIV感染者NKT样细胞的数量、CD57表达以及体外增殖能力有所恢复。

HIV；NKT样细胞；HAART

获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)，又称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的，以CD4+T细胞减少为主要特征的免疫缺陷综合征，伴有反复性机会感染和恶性肿瘤的发生，最终可以导致死亡。截至2014年底，中国目前存活的HIV感染者和病人报告数已达50万，可见艾滋病的流行和防控形势已不容乐观。通常认为，构成机体免疫系统的淋巴细胞有三种，一是由胸腺产生的T细胞，二是由骨髓分化而来能够产生抗体的B细胞，三是自然杀伤细胞(NK细胞)。其实还存在第四种淋巴细胞，也就是NKT样细胞。NKT样细胞是介于T细胞和NK细胞之间的一类特殊的淋巴细胞，其共表达T细胞受体和NK细胞受体[1,2]，是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁之一[3,4]。NKT样细胞能够产生IL-4等大量细胞因子，并且能够强有力的产生IFN-γ，从而发挥免疫调节作用和抗病毒作用[5,6]。因此，对HIV感染者HAART治疗前后的NKT样细胞进行研究，能够为HIV治疗提供更好的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1 研究对象本研究选取的未接受HAART治疗的HIV感染者均来自中国医科大学艾滋病研究所，且艾滋病确认实验为阳性。其中CD4+T细胞计数范围在160～979 cell/μl，均值为459.4 cell/μl；病毒载量范围在0～187 000 copies/ml，均值为32 521.4 copies/ml。HAART治疗者，入选标准为经过严格的至少两年的HAART治疗后，HIV病毒RNA<40 copies/ml，CD4+T细胞计数范围在156～719 cell/μl，均值为453.1 cell/μl。正常对照(Normal control，NC)，符合以下标准：HIV抗体阴性，血常规及肝肾功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性，无免疫系统疾病，未暴露于HIV的正常人。

1.1.2 主要仪器和试剂肝素抗凝负压真空采血管、CD3FITC/CD56PEcy7/HLA-DR-PerCP/CD57-PE等购于BD公司，流式细胞仪为BD公司FACSCalibur。

1.2方法

1.2.1NKT细胞衰老指标检测200 μl抗凝全血中加入4 ml溶血素，10 min后，离心，洗涤2次后加CD3-FITC、CD56-PEcy7荧光抗体染料进行NKT样细胞表面染色和CD57-PE的衰老标志染色。

1.2.2NKT细胞体外增殖能力检测新鲜全血提取PBMC后进行细胞计数，用不完全1640调整细胞浓度为2 million/ml，进行CFSE染色后37℃避光孵育15 min，冰上避光终止5 min后，用完全1640洗涤2次，加入96孔培养板中，200 μl/孔，刺激孔加入浓度为25 μl/ml的IL-15，培养5 d，3 d时换液，培养5 d后收集细胞，洗涤，进行NKT样细胞的表面染色，在LSR上检测NKT样细胞的体外增殖情况。

1.3统计学分析用GraphPad Prism 5统计软件进行统计学分析，实验指标两组间的比较采用Mann-WhitneyU检验，P<0.05为有统计学意义。

2　结果

2.1 HAART治疗前后NKT样细胞百分数变化情况对17例HAART治疗前和15例HAART治疗后的HIV患者以及12例健康对照者进行CD3/CD56表面染色，检测NKT样细胞百分数。结果显示：HAART治疗前NKT样细胞百分数明显低于NC组(P<0.01)，而经过HAART治疗后，NKT样细胞的百分数有所恢复(P<0.05)，见图1，差异具有统计学意义。

2.2HAART治疗前后NKT样细胞衰老情况将新鲜肝素抗凝全血进行NKT样细胞表面染色(CD3/CD56)及衰老成熟标志(CD57)染色。结果显示：HAART治疗前NKT样细胞CD57的表达量明显高于NC组，如图2，P<0.01，经HAART治疗后，CD57表达量有所下降，如图2，P<0.05，且具有统计学意义。

2.3 HAART治疗前后NKT样细胞体外增殖情况新鲜全血提取PBMC后进行CFSE染色，培养5 d后收细胞，进行NKT样细胞的表面染色，检测NKT样细胞的体外增殖情况。结果显示：HAART治疗前，NKT样细胞体外增殖能力明显下降，如图3，经HAART治疗后，体外增殖能力有所恢复，如图3。

图1　HAART治疗前后NKT样细胞百分数变化Fig.1　Percentage of NKT like cells before and after HAART Note: *.P<0.01，compared with healthy control group；#.P<0.05，compared with HIV infected group.

图2　HAART治疗前后NKT样细胞CD57的表达情况Fig.2　CD57 expression of NKT like cells before and after HAART Note: *.P<0.01，compared with healthy control group；#.P<0.05，compared with HIV infected group.

图3　HAART治疗前后NKT样细胞体外增殖情况Fig.3　Proliferation of NKT like cell before and after HAART in vitroNote: A.Healthy control individuals；B.HIV infected individuals without HAART；C.HIV infected individuals without HAART.

3　讨论

NKT样细胞是一群特殊的淋巴细胞，能够介导先天性免疫和适应性免疫。NKT样细胞的抗原识别不同于传统的T细胞和NK细胞，NKT样细胞不能识别MHCⅠ类和Ⅱ类分子提呈的抗原肽，只能识别细胞表面分子CD1d提呈的脂类和蛋白质抗原[7-9]。NKT样细胞在这些抗原的刺激下能够快速活化，并产生IL-4、IFN-γ和IL-10等大量细胞因子，从而在抗肿瘤、抗病毒感染、自身免疫性疾病以及移植免疫中发挥重要的作用[10,11]。因此，我们以中国HIV感染人群为研究对象，对NKT样细胞在HAART治疗前后的百分数、衰老情况和体外增殖能力等变化进行研究，从而探索NKT样细胞在HIV感染过程中的抗病毒作用及免疫调节作用，为临床上的进行抗HIV治疗提供理论指导。

我们的结果显示:HAART治疗前NKT样细胞百分数明显低于健康对照组(P<0.01)，而HAART治疗后NKT样细胞百分数可以恢复到正常水平(P<0.05)，说明对HIV感染者进行早期治疗是非常有必要的[12,13]，不仅可以延缓疾病进展，还有机会恢复到正常水平。我们发现HAART治疗前，NKT样细胞CD57的表达量明显高于NC组，如图2(P<0.01)，表明HIV感染可使NKT样细胞衰老加快，其快速的衰老会导致新生的NKT样细胞补充不足，最终导致NKT样细胞数量的下降。但究竟是什么原因促进了NKT样细胞的衰老成熟目前仍不清楚。但经过HAART治疗后，CD57的表达量可以慢慢恢复到正常水平(P<0.05)。

我们的研究还表明在HAART治疗前，NKT样细胞体外增殖的能力明显下降，如图3，而经HAART治疗后，体外增殖能力有所恢复，如图3。这说明HIV感染后，NKT样细胞增殖能力受到了损伤，而增殖能力的降低也会导致NKT样细胞数量的减少。同时体外增殖能力的降低也影响NKT样细胞功能的正常发挥，导致 NKT样细胞出现功能障碍[14]，其分泌IFN-γ的能力会下降，抗病毒感染的能力也会减弱。由此看来,虽然HIV感染能够改变NKT样细胞的数量、衰老程度以及体外增殖能力，但及时进行高效的抗病毒治疗，能够很好的控制HIV感染后的疾病进程。因此对HAART治疗前后的NKT样细胞的相关变化进行研究，可以为HAART治疗后的免疫恢复以及进一步治疗提供理论基础。

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[收稿2015-12-17修回2016-02-07]

(编辑许四平)

Study on senescence and proliferation of NKT like cells in HIV infected patients after antiviral therapy

ZHAO Xue，LIU Ting-Ting，ZHANG Zi-Ning，FU Ya-Jing，JIANG Yong-Jun.

Key Laboratory of AIDS Immunology of Ministry of Health,the First Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China

Objective:To better understand the changes of the NKT like cells after HIV infection and HAART treatment.Methods: Peripheral blood from HIV-infected individuals，HAART-treatment AIDS patients and healthy controls were collected， the expression of CD57 and the proliferation ability of NKT like cells before and after HAART were analyzed by flow cytometry.Results: We found that the percentage of NKT like cells before HAART was significantly lower than the healthy controls (P<0.01),and recovered after HAART treatment(P<0.05)；the aging of NKT like cells was significantly higher before HAART compared with health individuals (P<0.01)，and recovered after HAART treatment(P<0.05)the proliferation was significantly lower in vitro before HAART compared with healthy controls，and partial recovered after HAART.Conclusion: After HAART treatment,the number of NKT like cells,CD57 expression and the proliferation ability of HIV infected patients were restored.

Human immunoddficiency virus；NKT like cells；Highly active antiretroviral therapy

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.024

，E-mail：jiang jun55555@163.com。

赵雪(1985年-)，女，硕士，初级检验师，主要从事艾滋病免疫学研究。

R512.91

A

1000-484X(2016)09-1354-03

①本文为十二五科技重大专项(2014ZX10001002-001-004)和基础临床紧密结合平台项目(医大发字[2013]5号)。