Vδ2 γδ T细胞亚群在慢性HCV感染中的特征①

殷文伟　张琼方　邵建营　童师雯

(教育部感染性疾病分子生物学重点实验室，重庆医科大学病毒性肝炎研究所,重庆医科大学附属第二医院感染科，重庆400010)



Vδ2 γδ T细胞亚群在慢性HCV感染中的特征①

殷文伟张琼方邵建营童师雯②

(教育部感染性疾病分子生物学重点实验室，重庆医科大学病毒性肝炎研究所,重庆医科大学附属第二医院感染科，重庆400010)

目的：探讨γδT细胞及其亚群Vδ1和Vδ2 T细胞在慢性HCV感染中的作用。方法：采用流式细胞术检测人外周血γδT细胞及其亚群Vδ1和Vδ2 T细胞比例变化。结果：慢性HCV感染病人外周血中γδT细胞及其亚群Vδ1和Vδ2 T细胞比例与健康对照者相比无显著差异。相关性分析显示HCV感染患者Vδ2 T细胞数目与肝脏损伤成正相关而与病毒滴度不相关。慢性HCV感染病人Vδ2 T细胞处于活化状态,CD107a表达高于对照组。结论：Vδ2 T细胞亚群参与慢性HCV感染所致肝损伤。

丙型肝炎病毒;γδ T细胞;Vδ2 T细胞;病毒滴度;谷丙转氨酶

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染而引起的病毒性肝炎,具有感染率高、慢性化程度严重、疾病进展快，部分病人临床治疗效果不理想、治疗花费巨大等问题[1]。现在人们已经普遍认识到免疫系统在控制HCV感染和致肝脏损伤过程中起着非常重要的作用[2]。既往的研究主要关注CD8+T细胞和NK细胞在HCV感染中的作用，而对慢性HCV感染中另外一种重要的天然免疫细胞γδ T细胞研究较少[3]。

γδ T细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由γ和δ链组成。与αβ T细胞的TCR不同，γδ T细胞TCR缺乏多样性，可直接识别某些完整的多肽抗原[4]。γδ T细胞不仅具有高效的抗病毒和吞噬等典型的天然免疫功能，同时还可以作为特殊的抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)进一步活化适应性免疫应答 ，因而γδ T细胞被认为可能是连接机体天然免疫和特异性免疫功能的桥梁[5]。研究表明，γδ T细胞在感染、自身免疫性疾病及肿瘤发展中均发挥着重要功能[6]。γδ T细胞约占正常人外周血淋巴细胞总数的3%～5%,根据其δ链的不同分为Vδ1 T细胞和Vδ2 T细胞。其中，Vδ2 T细胞约占外周血γδ T细胞的90%，是外周主要γδ T细胞群体[7]。本研究中，我们研究了γδ T细胞及其亚群Vδ1 T和Vδ2 T细胞在慢性HCV感染中变化特征，并分析了其与疾病的相关性，旨在探讨慢性HCV感染的免疫机制，以期为HCV感染的免疫治疗提供线索。

1　材料与方法

1.1 研究对象本研究共入选重庆医科大学附属第二医院住院慢性HCV感染者37例，其中男性21例，女性16例，年龄28.6±7.53岁(20～55岁);所有患者均抗HCV阳性，病毒滴度1.413×107±1.257×107[(0.036 3～5.880)×107拷贝/ml]，转氨酶ALT值103±77.71(23～293 U/L)，入选HCV感染者均排除HIV、HBV感染，入选前半年均未接受免疫抑制剂或激素治疗。入选患者均签署知情同意书。健康对照者35名来源于门诊体检的健康人，男性20例,女性15例，年龄20～55岁，平均(30.4±8.56)岁。

1.2实验方法

1.2.1 标本采集入选患者均使用肝素抗凝管采集外周静脉血5 ml，采用Ficoll密度梯度分离法分离外周血单个核细胞(PBMC)。

1.2.2 流式抗体标记取约1×105PBMC,加入小鼠抗体IgG室温封闭10 min，分别加入荧光素标记的anti-CD3、anti-Vδ1 T、anti-Vδ2 T、anti-γδ T、anti-CD38、anti-CD69、anti-HLA-DR(均购于美国Ebioscience公司)。设同型对照。4℃避光标记30 min，PBS洗2遍，200 μl PBS重悬，转入流式管。

1.2.3CD107a检测取PBMC约1×106ml-1，加入唑来膦酸(10 μmol/L,美国Sigma公司)和anti-CD107a(美国Ebioscience公司)于1640完全培养基中37℃培养，18 h后，常规流式抗体标记。

1.2.4流式细胞检测染色后样品以BD FACSCantoTMⅡ流式细胞仪检测，数据以Flojo7.6.1软件进行分析。

1.3统计学处理应用GraphPad Prism 4.00 软件进行作图分析。采用非参数Mann Whitney 检验比较组间差异，Spearson 相关系数法用于相关性分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2　结果

2.1γδ T细胞及其亚群Vδ1 T和Vδ2 T细胞在慢性HCV感染中的变化分离人外周血单个核细胞，流式检测分析γδ T细胞及其亚群Vδ1 T和Vδ2 T细胞在健康对照者和HCV感染者之间的分布差异。检测结果显示：健康对照组循环γδ T细胞及其亚群Vδ1 T和Vδ2 T细胞百分率中位数分别为4.3%、0.608%、3.180%，HCV患者分别为4.731%、0.582%、3.465%，两组比较，差异不具有统计学意义(U=619.5,P=0.1603；U=621,P=0.6310；U=536.5,P=0.1575),见图1。

2.2慢性HCV感染患者Vδ2 T细胞数目与ALT成正相关，与HCV RNA不相关为进一步分析慢性HCV感染者γδ T细胞亚群Vδ1 T和Vδ2 T与疾病进程的相关性，我们分析了其数目与ALT和 HCV RNA的相关性，结果显示Vδ2 T细胞数目与ALT成正相关(r=0.341 7,P=0.033 3;图2C)，与HCV RNA不相关(r=-0.190 6,P=0.245 1;图2D)，而Vδ1 T细胞与ALT(r=0.028 93,P=0.853 9;图2A)，HCV RNA(r=0.020 16,P=0.897 9;图2B)均不存在相关性。

2.3HCV患者Vδ2 T细胞处于活化状态我们将研究聚焦于Vδ2 T细胞，分析显示慢性HCV感染组循环Vδ2 T细胞活化分子CD38、HLA-DR和CD69表达要显著高于健康对照组(U=28,P=0.028 0；U=53,P=0.014 1；U=37,P=0.040 9), 见图3。

2.4 HCV患者Vδ2T细胞高表达CD107aCD107a是目前公认的杀伤性细胞脱颗粒的标志，通过检测CD107a的表达可以反映淋巴细胞杀伤能力的高低。

图1　γδ T细胞及其亚群Vδ1 T细胞和Vδ2 T细胞在外周血中的分布比较Fig.1　Comparison of percentages of γδ T cells,Vδ1 T cells and Vδ2 T cells in healthy controls and HCV-infected patientsNote: A.Representative dot plots of peripheral blood γδ T,Vδ2 T and Vδ1 T cells from HCs and HCV-infected patients；B.Percentages of total γδ,Vδ2,and Vδ1 T cells in peripheral blood of HCs and HCV-infected patients.

图2　HCV患者Vδ2 T细胞数目与ALT成呈相关，与HCV RNA不相关Fig.2　Number of Vδ2 T cells in HCV-infected patients showed positive correlation with serum ALT levels but not with serum HCV RNA loadsNote: A，B.Correlation analysis of the number of Vδ1 T cells and the serum ALT levels (A) or HCV RNA loads (B) in HCV-infected patients.C，D.Correlation analysis of the number of Vδ2 T cells and the serum ALT levels (C) or HCV RNA loads (D) in HCV-infected patients.

图3　HCV患者Vδ2 T细胞处于活化状态Fig.3　Analysis of activation status of Vδ2 T cells in HCV-infected patientsNote: A.Representative flow cytometry panels depict the expression of the activation markers CD38,HLA-DR and CD69 on Vδ2 T cells from HCs and HCV-infected patients；B.Frequency of Vδ2 T cells expressing CD38,HLA-DR and CD69 in HCs and HCV-infected patients.

我们分析了慢性HCV患者Vδ2 T细胞亚群CD107a表达情况，检测结果显示慢性HCV感染组Vδ2 T细胞CD107a表达明显高于健康对照组(U=10,P=0.022 9),见图4。

图4　HCV患者Vδ2 T细胞高表达CD107aFig.4　Analysis of expression of CD107a on Vδ2 T cells in HCV-infected patientsNote: A.Representative dot plots depicting the expression of CD107a on Vδ2 T cells from HCs and HCV-infected patients;B.Frequency of Vδ2 T cells expressing CD107a in HCs and HCV-infected patients.

3　讨论

肝脏被称为是一个“天然免疫优势”器官，其淋巴细胞群中包含大量的天然免疫细胞如NK细胞、γδ T细胞[8]。相比较NK细胞，γδ T细胞在肝脏相关感染和疾病中的研究还比较少，这可能是由于其在外周含量较低，给其研究带来了困难所致[9]。本研究探讨了慢性HCV感染中外周血γδ T细胞及其亚群Vδ1 T和Vδ2 T细胞的变化情况并分析了其与疾病特征的相关性。

本研究中，我们首先分析了外周血中γδ T细胞及其亚群Vδ1 T和Vδ2 T细胞比例在慢性HCV感染后的变化特点，与健康对照组相比，我们并没有发现很显著的差异，这可能是由于慢性HCV感染导致其他淋巴细胞亚群的变化进而影响到γδ T细胞群体变化所致。下一步研究需要通过准确计数健康对照者和HCV患者外周血淋巴细胞数目来判定γδ T细胞及其亚群Vδ1 T和Vδ2 T细胞的数目变化规律。

我们通过分析Vδ2 T细胞数目和肝损伤指标ALT和HCV RNA拷贝之间的相关性，发现Vδ2 T细胞数目与ALT成正相关，而与HCV RNA不相关，这表明慢性HCV感染中Vδ2 T细胞主要起致肝损伤作用而非抗病毒。外周Vδ1 T细胞数目与ALT和HCV RNA均无相关性，推测其在HCV感染中可能并不发挥主要作用。

通过分析Vδ2 T细胞的活化特征，我们发现Vδ2 T细胞高表达活化指标CD38、HLA-DR、CD69，说明慢性HCV持续感染会活化Vδ2 T细胞，接着我们发现HCV感染者Vδ2 T细胞高表达CD107a,说明慢性HCV感染者中活化的Vδ2 T细胞杀伤能力增强，结合前面其数目与转氨酶成正相关结果，推测Vδ2 T细胞杀伤功能可能主要发挥致肝损伤效应[10]。

综上所述，慢性HCV患者外周血中Vδ2 T细胞处于活化状态，高表达CD107a,且其数目与转氨酶呈正相关，提示Vδ2 T细胞参与介导了HCV感染中肝损伤。关于Vδ2 T细胞在慢性HCV感染中的功能特征和致损伤分子机制还需要进一步研究。

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[收稿2015-12-03修回2016-01-07]

(编辑倪鹏)

Characteristics of Vδ2 γδ T cells in patients with chronic hepatitis C

YIN Wen-Wei,ZHANG Qiong-Fang,SHAO Jian-Ying,TONG Shi-Wen.

Key Laboratory of Molecular Biology for Infectious Diseases (Ministry of Education),Institute for Viral Hepatitis,Department of Infectious Diseases,the Second Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China

Objective:To study the role of γδ T cells and Vδ1 and Vδ2 T subsets played in patients with chronic hepatitis C.Methods: The percentage of peripheral blood γδ T cells and Vδ1 and Vδ2 T subsets cells was assessed by flow cytometry (FACS).Results: There were no significant differences in the percentage of circulating γδ T cells and Vδ1 and Vδ2 T subsets between HCV-infected patients and healthy controls (HCs).However,The number of peripheral blood Vδ2 T cells from HCV-infected patients was positively correlated with serum alanine aminotransferase (ALT) levels,but showed no correlation with serum HCV RNA.Peripheral Vδ2 T cells from HCV-infected patients were in activated status.The expression of CD107a was enhanced in Vδ2 T cells from HCV-infected patients compared to HCs.Conclusion: Vδ2 T cells were involved in liver injury in chronic HCV-infected patients.

HCV; γδ T cell;Vδ2 T cell;Viral titer;ALT

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.022

殷文伟(1983年-)，男，博士，助理研究员，主要从事病毒性肝炎的免疫学机制研究，E-mail:ustcyww@163.com。

及指导教师：童师雯(1983年-)，女，博士，主治医师，主要从事病毒性肝炎的免疫学及分子机制研究，E-mail:tsw129qq2001@163.com。

R512.6+3

A

1000-484X(2016)09-1346-04

①本文为国家自然科学基金项目(81401664,81301423)、中国博士后科学基金资助项目、重庆市博士后科学基金资助项目(Xm2014132)和重庆市前沿与应用基础研究(一般)项目(cstc2015jcyjA10071)。

②重庆医科大学附属第二医院临床营养科，重庆 400010。