固有免疫功能相关的microRNAs在布鲁氏菌病患者中的表达情况①

郑源强　于玖轩　韩新荣　石艳春

(内蒙古医科大学自治区分子生物学重点实验室，呼和浩特010058)



·基础免疫学·

固有免疫功能相关的microRNAs在布鲁氏菌病患者中的表达情况①

郑源强于玖轩韩新荣②石艳春

(内蒙古医科大学自治区分子生物学重点实验室，呼和浩特010058)

目的：研究与固有免疫相关的14种microRNAs在布病患者中的表达情况。方法：采用实时定量PCR方法，测定布病患者和健康志愿者血清中microRNAs的表达水平。结果：在检测的14种microRNAs中，13种在布病患者中表达下调，其中布病患者和健康志愿者之间的Ct值差异>1的microRNAs共有9种，并且miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a这5种microRNAs在布病患者血清中的表达水平明显降低(P<0.01)。结论：布病患者中miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a的表达被明显抑制，在布病诊断中具有潜在的应用价值。

固有免疫；microRNAs；布鲁氏菌病；生物诊断标记

布鲁氏菌病(简称布病)是一种全球广泛流行的人畜共患病，为我国法定乙类传染病。布病不仅造成巨大的经济损失，而且严重威胁生命健康与安全，已成为一种重大公共卫生问题。布病患者往往缺乏典型的症状，临床表现主要包括发热、出汗、关节痛/关节炎、肝脾肿大、肌肉疼痛等[1]。临床实践中，布病容易被误诊或延迟诊断，导致疾病慢性化，迁延难治。核酸检测已被证实可用于布病早期诊断，使诊断窗口前移[2]。然而，由于临床样本中布氏菌的浓度极低、血清抗体与细菌DNA水平之间一致性较低等问题，难以对诊断技术和疾病预后进行评估。因此，与宿主免疫应答相关的新型生物标记对布病诊断和预后判断具有重要的价值。

microRNAs(miRNAs)是一类约为22个核苷酸大小的非编码单链RNA，对多种生物功能具有重要的调节作用[3,4]。已证实miRNAs参与病原体感染中宿主的固有免疫和获得性免疫应答过程[5,6]。miRNAs作为诊断或预后判断的生物标记已在许多类型疾病中被证实。然而，相比于在肿瘤中已知的重要作用，miRNAs在感染性疾病尤其是细菌感染所致疾病中的作用还研究较少。布氏菌能够利用多种机制抵御宿主固有免疫应答，从而有利于布氏菌在宿主内长期存活并形成持续性慢性感染[7]。布氏菌感染是否会影响血清中与固有免疫应答相关miRNAs的表达尚不清楚。本研究中，我们分别利用混合样品和训练样品，分析布病患者和健康志愿者中与固有免疫相关miRNAs的表达水平，探讨这些miRNAs作为布病新型生物诊断标志的可行性。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1临床资料2015年5月～2015年6月期间在布病门诊收集的布病患者全血和血清样本。血清样本收集后采用试管凝集试验(SAT)进行抗体检测，抗体滴度高于1∶50者诊断为布病患者。全血样本(2 ml)于-20℃保存。健康志愿者与布病患者来自同一地区(性别和年龄均符合要求)，经SAT检测确认为非布病患者。

1.1.2主要试剂RNA提取试剂盒(南京命码生科科技有限公司产品)；TaqMan miRNA PCR Kit(ABI公司产品)；rTaq DNA Polymerase[宝生物工程(大连)有限公司产品]；人工合成的人miRNAs模拟物购自上海吉玛制药技术有限公司；PCR扩增所需引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。14种与固有免疫相关的miRNAs见表1。

1.2方法

1.2.1样本分组混合样本分别由20名布病患者和20名健康志愿者样本组成，用于筛选表达水平有差异的miRNAs。训练样本包括24例布病患者样本(阳性样本)和8例健康志愿者样本(阴性样本)。

1.2.2血浆制备及RNA提取全血样本经2 500 r/min离心10 min获得血浆上清。利用RNA提取试剂盒从100 μl血浆样本中提取总RNA。100 μl血浆样本与300 μl无RNase水、200 μl苯酚和200 μl氯仿混匀，涡旋混匀后于室温条件下放置15 min。混合物于12 000 r/min离心10 min后收集位于上层的水相层。加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠溶液和2倍体积的异戊醇。置于-20℃中1 h以沉淀总RNA。14 000 r/min离心20 min收集RNA，75%乙醇洗涤1次，室温干燥10 min后重溶于20 μl无RNase水。

1.2.3定量RT-PCR(qRT-PCR)采用探针法，操作方法按试剂盒说明书进行。为了计算目标miRNAs的表达水平，合成了一系列已知浓度的miRNAs寡核苷酸用水稀释后进行反转录和扩增。目标miRNAs的表达水平参比标准曲线进行计算。

1.2.4miRNAs的筛选与检测首先，利用混合样本筛选在布病患者和健康志愿者之间具有差异表达的miRNAs。然后将差异表达的miRNAs放到训练样本中进行检测。

表114种与固有免疫相关的miRNAs

Tab.1Fourteen selected innate immunity related miRNAs

NameRelationshipwithinfectionRelationshipwithinnateimmunitySequence(5'-3')miR-122YesYesUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGmiR-132YesYesAACCGUGGCUUUCGAUUGUUACmiR-145aYesYesGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUmiR-146bYesYesUGAGAACUGAAUUCCAUAGGCUmiR-155YesYesUUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGUmiR-223YesYesCGUGUAUUUGACAAGCUGAGUUGmiR-181aNoYesAACAUUCAACGCUGUCGGUGAGUmiR-181cYesYesAACAUUCAACCUGUCGGUGAGUmiR-181dYesYesAACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGUmiR-301aNoYesGCUCUGACUUUAUUGCACUACUmiR-27aYesYesAGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCAmiR-29aYesYesACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAGmiR-29b-1YesYesGCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAmiR-146aYesYesUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU

2　结果

2.1布病患者中差异表达的miRNAs筛选结果利用混合样本进行qRT-PCR 检测，结果表明：Ct值差异>1的miRNAs一共有9种：miR-122、miR-145a、miR-146b、miR-155、miR-223、miR-181d、miR-301a、miR-29a和miR-146a(图1A)。除了miR-132以外，其他13种miRNAs在阳性样本的Ct值均高于阴性样品相应的Ct值。上述13种miRNAs的Ct值变化范围为0.5～3.6，Ct值差异>1的9种miRNAs倍数变化范围从3.5(miR-145a)至15.3(miR-181d)(图1B)。

2.2miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a在布病患者中表达量明显降低为了验证所筛选的Ct值差异>1的9种miRNAs在布病患者中的表达是否受到抑制，采用由24个布病患者样本和8个年龄、性别和临床表现均符合要求的健康志愿者样本组成的训练样本(表2)，分别检测这9种miRNAs的表达水平。实验结果表明：miR-122、miR-155、miR-181d、miR-301a、miR-145a和miR-146a共6种miRNAs在布病患者和健康志愿者之间的表达水平差异具有统计学意义(P<0.05)，并且除miR-181d以外的其他5种miRNAs在两组样本中的表达差异具有显著统计学意义(P<0.01，图2)。5种miRNAs的标准曲线(图3)。

图1　利用混合样本筛选差异表达的miRNAsFig.1　miRNAs screening with pooled samples of patients and healthy volunteersNote: Ct value comparison (A) and fold change (B) of miRNA candidates between brucellosis patients and healthy control are shown;*.P<0.05.

表2训练样本相关信息

Tab.2Demography of training panel

IndexPatients(n=24)Healthyvolunteers(n=8)PvalueSex(n,%)Female6(25%)2(25%)1AgeMean47.1740.380.116395%CI43.31-51.0229.17-51.58SATtiter(n,%)1∶508(33.33%)1∶10010(41.67%)1∶2006(25%)Symptom(n,%)Fever17(70.83%)4(50%)Fatigue10(41.67%)4(50%)Jointpain14(58.33%)3(37.5%)χ2=1.174,P=0.8824Legpain9(37.5%)4(50%)Sweat11(45.83%)3(37.5%)

图2　9种miRNAs在布病患者和健康志愿者的表达情况比较Fig.2　Comparisons of miRNAs between brucellosis patients and healthy volunteersNote: NS.Indicates a lack of statistical significance；*.P<0.05；**.P<0.01.

图3　5种miRNAs的标准曲线Fig.3　Standard curve of five miRNAs

3　讨论

布鲁氏菌病(简称布病)是由布氏菌感染所致的一种人畜共患传染病，不具有典型的临床症状并易形成慢性感染性疾病。目前，布病患者的精确临床诊断面临着许多挑战。由于具有良好的稳定性，血清或血浆中的miRNAs作为诊断的生物标志已成为疾病诊断和预后判断等领域的研究热点[8,9]。血清miRNAs的表达水平往往与机体状态存在密切关系，也使miRNAs有望成为精确诊断的良好标志物。布氏菌能够通过多种机制抑制宿主免疫应答，使其能够在宿主体内长期存活并形成慢性感染。基于这些情况，我们提出了假设：与机体固有免疫功能调节相关的miRNAs在布病患者和健康人之间的表达水平可能存在差异。

在本研究中，我们采用了混合样本筛选和训练样品检测的研究策略。首先我们选择了14种已知且功能比较明确的，与免疫调节或者感染有关的miRNAs作为研究对象，利用混合样本分别检测了这些miRNAs在布病患者和健康志愿者血浆中的表达水平。有意思的是，其中13种miRNAs在布病患者样本中表达下降。这一发现说明，虽然可能存在一定的偏好，但布病患者存在许多种miRNAs的表达受到抑制。这些差异表达的miRNAs可能在布氏菌抵御宿主免疫应答中发挥作用。利用由24名布病患者和8名健康志愿者血浆组成的训练样本对筛选到的9种显著差异表达的miRNAs进行检测，结果发现，miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a在布病患者中表达量明显降低，两组样本之间表达差异具有显著统计学意义(P<0.01)。综合本研究结果，布病患者血浆或血清中多种miRNAs表达受到明显抑制，其中miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a这5种miRNAs在布病患者和健康志愿者之间的表达差异尤为明显。上述实验结果为进一步了解布病患者miRNAs表达水平与布氏菌感染状况、临床治疗措施之间的关系奠定了良好的基础。近年来，国内外研究学者已发表了许多有关miRNAs作为生物标志的研究报道。这些研究结果提示，miRNAs可作为疾病的分期、分级、疾病预测以及临床干预措施监测等生物标志[10，11]。通过实验，我们初步筛选并证实了5种miRNAs在布病患者与健康对照组中表达存在显著性差异，但这些miRNAs能否成为布病诊断和预后判断的生物标志尚待进一步研究。

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[收稿2016-04-26]

(编辑倪鹏)

Expression pattern of innate immunity related microRNAs in human brucellosis

ZHENG Yuan-Qiang,YU Jiu-Xuan,HAN Xin-Rong,SHI Yan-Chun.

Inner Mongolia Key Laboratory of Molecular Biology,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010058,China

Objective:To investigate the expression pattern of 14 innate immunity related microRNAs (miRNAs) in brucellosis patients.Methods: By using Real time PCR assay,expression levels of 14 miRNAs in serum samples from brucellosis patients and healthy volunteers were analyzed.Results: Of the 14 miRNAs tested,13 showed decreased expression in brucellosis patients.And significant Ct differences over one were observed for nine of the miRNAs.In them,five miRNAs,including miR-122,miR-145a,miR-155,miR-301a and miR-146a levels significantly decreased in brucellosis patients (P<0.01).Conclusion: Decreased serum levels of miR-122,miR-145a,miR-155,miR-301a and miR-146a are confirmed and may serve as novel biomarkers for human brucellosis diagnosis.

Innate immunity;microRNAs;Brucellosis;Biomarker

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.002

郑源强(1980年-)，男，在读博士，副教授，主要从事抗感染免疫研究，E-mail: zhengyq688@163.com。

及指导教师：韩新荣(1957年-)，男，硕士，教授，主要从事中医药免疫研究。

石艳春(1958年-)，女，医学博士，教授，主要从事抗感染免疫与疫苗研究，E-mail: ycshi5388@163.com。

R392.7

A

1000-484X(2016)09-1253-04

①本文受国家“十二五”科技支撑计划项目(2014BAI13B03)、国家自然科学基金(81460248、81260457)、内蒙古自治区科技重大专项、内蒙古自治区自然科学基金(2013MS1138、2012MS1121、2015MS0820)、内蒙古自治区科技计划项目(20120101、20120402、20110501)、内蒙古自治区卫计委医疗卫生科研计划项目(201301035、2010018)、内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZY109)资助。

②内蒙古医科大学护理学院，呼和浩特010058。