可溶性CD40配体对人B细胞淋巴瘤细胞系BJAB增殖、凋亡的影响及其机制

任明强，陈琦，毛星星

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563003)



可溶性CD40配体对人B细胞淋巴瘤细胞系BJAB增殖、凋亡的影响及其机制

任明强，陈琦，毛星星

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563003)

目的观察可溶性CD40配体(sCD40L)对人B细胞淋巴瘤细胞系BJAB增殖、凋亡的影响，并探讨其机制。方法 培养BJAB细胞并将其分为实验组、阳性对照组、空白对照组。实验组分别加入0、1、2、3、4、5、6、7 g/mL的sCD40L，空白对照组加入同量生理盐水，阳性对照组加入10 mol/L的地塞米松。用不同浓度为的sCD40L作用于BJAB细胞，在24、48、72 h用MTT 法测算细胞增殖抑制率；应用流式细胞术观察凋亡细胞及不同周期细胞；采用Western blotting法检测细胞中的Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白。结果 阳性对照组及实验组不同浓度sCD40L处理的细胞培养48、72 h后增殖抑制率高于培养24 h时(P均<0.05)。随着sCD40L作用浓度升高，实验组BJAB细胞增殖抑制率升高。实验组、阳性对照组G1期细胞百分比增高，S期细胞百分比下降；实验组中，6 g/mL亚组G1期细胞百分比高于2、4 g/mL亚组，S期细胞百分比低于2、4 g/mL亚组(P均<0.05)。实验组、阳性对照组细胞凋亡率高于空白对照组(P均<0.05)；实验组中6 g/mL亚组细胞凋亡率低于阳性对照组(P<0.05)。实验组及阳性对照组细胞中Bax、Caspase-3蛋白相对表达量高于空白对照组，Bcl-2蛋白相对表达量低于空白对照组(P均<0.05)。结论 sCD40L可抑制BJAB细胞增殖、诱导其凋亡，机制可能与上调Bax、Caspase-3蛋白表达及下调Bcl-2蛋白表达和干扰细胞周期有关。

可溶性CD40配体；淋巴瘤;B细胞淋巴瘤；细胞增殖；细胞周期；细胞凋亡

B细胞淋巴瘤是一种在病理形态、临床表现、治疗及预后等方面都有较大异质性的恶性肿瘤[1]。在亚洲国家，B细胞淋巴瘤约占淋巴瘤的60%，以40～50岁者多见。部分B细胞淋巴瘤患者在标准R-CHOP方案化疗、自体造血干细胞移植治疗后，仍容易复发，长期生存率低，故探索新的治疗药物与治疗策略尤为必要。CD40配体(CD40L)主要表达于T淋巴细胞和活化的血小板，在肥大细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞中也有表达。CD40L在血浆中以可溶性蛋白形式(sCD40L)存在，sCD40L可参与抗肿瘤免疫反应，可通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞从G0期进入G1期，从而诱导细胞凋亡[2]。目前，关于sCD40L对人B细胞淋巴瘤细胞的作用所知甚少。我们前期研究显示，sCD40L在恶性淋巴瘤患者血清中呈显著低表达，可作为弥漫大B细胞淋巴瘤患者有价值的预后指标。研究[3,4]也显示sCD40L在弥漫大B细胞淋巴瘤中呈低表达。然而关于sCD40L在B细胞淋巴瘤中的具体作用机制还不明确。因此，本研究采用不同浓度的sCD40L处理BJAB细胞，观察其增殖、凋亡和细胞周期分布情况，并检测相关凋亡蛋白，探讨sCD40L对BJAB细胞的作用及可能机制。

1　材料与方法

1.1细胞、试剂与仪器人B细胞淋巴瘤细胞系BJAB购自中国科学院上海细胞生物研究所。sCD40L，链霉素，青霉素，Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡试剂盒，化学发光试剂盒，MTT试剂盒、DMSO、蛋白提取试剂盒，BCA蛋白质定量试剂盒，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，PVDF膜，Bcl-2/Bax/Caspase-3一抗及二抗。CO2培养箱，倒置相差显微镜，超净工作台，酶标测定仪，恒温烤箱，分析天平，台式低速离心机，低温高速离心机，低温冰箱，24孔及96孔培养板，流式细胞仪，细胞培养瓶，Image Lab凝胶成像仪。

1.2细胞分组与sCD40L用法复苏后的BJAB细胞用含10%灭活胎牛血清的1640培养基置入37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，每2～3 d用0.25%胰酶消化并1∶2传代，定期观察细胞形态学变化。取对数生长期的BJAB细胞接种到96孔板中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h后吸出原培养液。将BJAB细胞分为实验组、空白对照组和阳性对照组。实验组分别加入1、2、3、4、5、6、7 g/mL的sCD40L，空白对照组加入同量生理盐水，阳性对照组加入10 mol/L的地塞米松。每组5个复孔。

1.3BJAB细胞增殖抑制率测算采用MTT法。各组继续培养24、48、72 h后加入MTT 20 μL，继续培养4 h后终止培养，弃上清，每孔加入 DMSO 100 μL震荡10 min以溶解结晶。在570 nm波长下用酶联免疫监测仪测量吸光度(OD)值，细胞增殖抑制率=(1-实验组成阳性对照组OD值)/对照组OD值×100%。

1.4BJAB细胞周期检测及凋亡情况观察培养48 h后收集空白对照组、阳性对照组细胞，收集实验组经2、4、6 g/mL的sCD40L处理的细胞，PBS洗涤细胞2次，加70%乙醇1 mL固定，4 ℃冰箱过夜，离心后再用PBS洗3次，加入牛胰核糖核酸酶，37 ℃孵育30 min，碘化丙啶(PI)4 ℃避光染色，流式细胞仪检测，以ModFit LT软件分析并计算各时相细胞百分比。用500 μL的PBS重悬细胞，加入的Annexin V-FITC避光孵育15 min，再加入PI避光孵育5 min，流式细胞仪分析并计算细胞凋亡率。

1.5BJAB细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白检测培养48 h后收集空白对照组、阳性对照组细胞及实验组经2、4、6 g/mL的sCD40L处理的细胞，PBS洗2次，裂解，离心，收集上清，按蛋白提取试剂盒操作步骤提取细胞总蛋白；在上样缓冲液加入等量蛋白，煮沸，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，电转至PVDF膜，封闭液室温封闭75 min；分别加入Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAPDH一抗4 ℃过夜，加入HRP标记二抗，摇床上室温孵育1 h，滴加发光试剂；图片经图像扫描仪扫描，采用AlphaEase FC软件对图片进行灰度值分析。以GAPDH作内参，以相对于对照组灰度值的倍数表示目的蛋白相对表达量。

1.6统计学方法采用SPSS18.0软件进行统计分析。计量资料多样本均数比较采用单因素方差分析；分类变量比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组BJAB细胞增殖抑制率比较阳性对照组及实验组不同浓度sCD40L处理的细胞培养48、72 h后增殖抑制率高于培养24 h时(P均<0.05)。随着sCD40L作用浓度升高，实验组BJAB细胞增殖抑制率升高。详见表1。

表1　各组BJAB细胞增殖抑制率比较

注：与同组培养24 h时相比，*P<0.05。

2.2各组不同周期细胞分布及细胞凋亡率比较实验组、阳性对照组G1期细胞百分比增高，S期细胞百分比下降；实验组中，6 g/mL亚组G1期细胞百分比高于2、4 g/mL亚组，S期细胞百分比低于2、4 g/mL亚组(P均<0.05)。实验组、阳性对照组细胞凋亡率均高于空白对照组(P均<0.05)；实验组中6 g/mL亚组细胞凋亡率与阳性对照组无统计学差异。详见表2。

表2　各组细胞周期细胞分布、细胞凋亡率比较±s)

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与实验组6 g/mL亚组相比，#P<0.05。

2.3各组细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达比较实验组及阳性对照组细胞中Bax、Caspase-3蛋白相对表达量高于空白对照组，Bcl-2蛋白相对表达量低于空白对照组(P均<0.05)。见表3。

3　讨论

B细胞淋巴瘤作为一种常见的淋巴瘤类型，目前主要采用利妥昔单抗联合CHOP方案(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)进行标准一线治疗，治疗效果总体较好，但由于该肿瘤有高度异质性，治疗中易出现耐药、复发，影响患者预后与长期生存[5]，进一步寻找新的治疗药物与策略尤为必要。CD40L属于肿瘤坏死因子超家族一员，sCD40L具有与膜性CD40L相同的生物学作用，在肿瘤细胞增殖调控、免疫应答及抗原递呈方面发挥重要作用[6]。近年来，sCD40L体外对肿瘤细胞生物活性的影响成为研究热点。sCD40L是一种跨膜糖蛋白，是CD40L在血浆中存在的形式，具有细胞因子样活性[7]。大量研究表明，sCD40L在胃癌、肺癌和肝癌等多种肿瘤中有免疫正向调节和抗肿瘤作用，可诱导肿瘤细胞凋亡[8,9]。我们前期研究发现，sCD40L在淋巴瘤、白血病患者外周血中低表达，sCD40L缺乏与淋巴瘤、白血病的发病有关[10,11]。

表3　各组细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相对表达量比较

注：与空白对照组相比，*P<0.05。

地塞米松是淋巴系统血液肿瘤化疗常用的药物之一，对淋巴瘤细胞有抑制、杀灭作用，故本研究将地塞米松作为阳性对照组，目的是为观察sCD40L对淋巴瘤的作用提供参照。本研究采用不同浓度的SCD40L分别处理BJAB细胞24、48、72 h后，发现sCD40L可明显抑制细胞增殖，并呈一定的时间和剂量效应关系，这可能与sCD40L抑制DNA复制过程中关键酶活性、影响生长调节因子分泌、抑制肿瘤细胞自分泌活性氧有关。肿瘤细胞的增殖速度主要取决于细胞周期的长短，其中G1期停滞会使细胞周期增长而导致细胞出现凋亡。我们通过流式细胞术检测发现，随sCD40L作用浓度增加，BJAB细胞凋亡率增加，S期细胞百分比减少，G1期细胞百分比增加，提示sCD40L可使BJAB细胞的细胞周期阻滞在G1期，可能是sCD40L诱导BJAB细胞凋亡的机制之一。一些关于sCD40L与其他肿瘤细胞的研究也支持上述观点[12～14]。

Caspase-3是Caspase家族成员中执行细胞凋亡的关键酶之一，多种刺激因素都能激活Caspase-3，然后裂解多种蛋白，阻止DNA复制和细胞修复，最终引起细胞凋亡。Caspase-3活化程度也是判断细胞凋亡程度的相关指标之一[15,16]。Bax基因位于染色体19q13,该基因具有保守性，含6个外显子，广泛分布于人体多种组织，Bax与Bcl-2部分氨基酸同源。Bcl-2基因位于18q21.3染色体片段，有3个外显子，Bcl-2蛋白是Bcl-2基因表达的蛋白产物，分子量为26 kD，主要位于内质网、核膜和线粒体膜。Bcl-2可通过改变线粒体巯基的氧化还原状态、调节线粒体膜对一些凋亡蛋白前体的通透性等机制抑制细胞凋亡[17,18]。Bcl-2与Bax、Caspase-3蛋白参与构成线粒体通路，分别具有抑制和促进细胞凋亡的作用[19，20]。本研究发现sCD40L可诱导BJAB细胞发生凋亡，同时影响细胞中凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达。随着sCD40L作用浓度增高，促凋亡因子Caspase-3、Bax的相对表达量逐渐升高，抗凋亡因子Bcl-2的表达量逐渐降低，这提示sCD40L能使BJAB细胞线粒体中的Bcl-2/Bax/Caspase-3信号通路激活，作用机制可能为sCD40L引起Bcl-2表达减少，线粒体膜电位降低、膜通透性增高，使细胞色素C、Ca2+凋亡蛋白释放至细胞质中，激活Caspase-3、Bax，导致蛋白质水解，破坏细胞核内染色质，促使细胞结构破坏，最终诱发细胞凋亡。

结合上述研究结果，我们认为，sCD40L在体外可抑制B淋巴瘤细胞增殖、促进其凋亡，机制可能与调控Bcl-2/Bax/Caspase-3信号通路及影响细胞周期有关。这为sCD40L用于B细胞淋巴瘤治疗的相关研究提供了实验基础。

[1] Ren YR, Jin YD, Zhang ZH, et al. Rituximab treatment strategy for patients with diffuse large B-cell lymphoma after first-line therapy: a systematic review and meta-analysis[J]. Chin Med J (Engl), 2015,128(3):378-383.

[2] 白琳,王云枝,邓洋.sCD40L、IL-10与DM2患者微血管病变的相关性研究[J].放射免疫学杂志,2013,26(2):192-194.

[3] 黄丽娟,陈琦,李佑福.恶性淋巴瘤血清中可溶性CD40配体与肿瘤坏死因子α表达的临床意义[J].临床荟萃,2009,24(9):764-766.

[4] 杨丽娟,崔为发,王占聚,等.弥漫大B细胞淋巴瘤血浆中sCD40L的检测及意义[J].中外医疗,2012,31(7):19-20.

[5] Cabanillas F. Rituximab in DLBCL: 6 years on[J]. Lancet Oncol, 2011,12(11):984-985.

[6] Hellings PW, Kasran A, Bullens D, et al. IL-10 and IL-12 independent down regulation of allergic sensitization by stimulation of CD40 signaling[J]. J Immunol, 2006,177(8):5138-5144.

[7] Aloui C, Prigent A, Sut C, et al. The signaling role of CD40 ligand in platelet biology and in platelet component transfusion[J]. Int J Mol Sci, 2014,15(12):22342-22364.

[8] Zhang ZM, Yang XM, Zhang C, et al. Antitumor effects and mechanisms of dendritic cells stimulated by sCD40L on ovarian cancer cells in vitro[J]. Oncol Targets Ther, 2013,6(1):503-515.

[9] Solooki S, Khozaei A, Shamsdin SA, et al. sCD30 and sCD40L detection in patients with osteosarcoma, chondrosarcoma and Ewing sarcoma[J]. Iran J Immunol, 2013,10(4):229-237.

[10] 李娟,陈琦,任明强,等.急性髓细胞白血病血浆中sCD40L表达的研究[J].遵义医学院学报, 2010,33(6):543-544.

[11] 任明强,陈琦.非霍奇金淋巴瘤血浆中sCD40L检测及意义[J].肿瘤防治研究,2009,36(7):587-589.

[12] 刘珊,陈波.sCD40L联合长春瑞滨对肺腺癌A549细胞的作用[J].中国肺癌杂志,2010,13(7):686-689.

[13] Leveille C, Bouillon M, Guo W, et al. CD40 ligand binds to 5beta1 integrin and triggers cell signaling[J]. JBC, 2007,282(8):5143-5151.

[14] Li R, Chen WC, Pang XQ, et al. Combined effect of sCD40L and PI3K siRNA on transplanted tumours growth and microenvironment in nude mice with gastric cancer[J]. Mol Biol Rep, 2012,39(9):8755-8761.

[15] 王继慧,张小卿,马月丹,等.绞股蓝总皂苷对光老化人皮肤成纤维细胞Caspase-3信号通路的影响[J].中国全科医学,2014,17(18):2109-2114.

[16] Zhou MI, Chen DL, Jiang T, et al. Effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells transfected with survivin on pulmonary fibrosis in mice[J]. Exp Ther Med, 2015,10(5):1857-1864.

[17] Shvetsov AV, Dyuzhikova NA, Savenko YN, et al. Effects of experimental coma on the expression of Bcl-2 protein and caspases 3 and 9 in rat brain[J]. Bull Exp Biol Med, 2015,160(2):216-218.

[18] Adem J, Ropponen A, Eeva J, et al. Differential expression of Bcl-2 family proteins determines the sensitivity of human follicular lymphoma cells to dexamethasone-mediated and anti-BCR-mediated apoptosis[J]. J Immunother, 2015,39(1):8-14.

[19] Martelli M, Ferreri AJ, Agostinelli C, et al. Diffuse large B-cell lymphoma[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2013,87(2):146-171.

[20] Pfreundschuh M, Trumper L, Osterborg A, et al. CHOP-like chemotherapy plus rituximab versus CHOP-like chemotherapy alone in young patients with good-prognosis diffuse large-B-cell lymphoma: a randomised controlled trial by the MabThera International Trial (MInT) Group[J]. Lancet Oncol, 2006,7(5):379-391.

Effects of soluble CD40 ligand on proliferation and apoptosis of Human B cell lymphoma cell line BJAB and its mechanism

RENMingqiang,CHENQi,MAOXingxing

(AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China)

ObjectiveTo observe the effects of soluble CD40 ligand (sCD40L) on cell proliferation and apoptosis of human lymphoma BJAB cell line and to investigate its mechanism. MethodsBJAB cells were cultured and then were divided into the experimental group, positive control group and blank control group. The 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 7 g/mL sCD40L were separately added to the experimental group, the same amount of normal saline was added to the blank control group, and 10 mol/L dexamethasone was added to the positive control group. Different concentrations of sCD40L were applied to BJAB cells at 24, 48 and 72 h. MTT assay and flow cytometry (FCM) were used to detect the inhibition rate, apoptosis and cell cycle distribution, respectively. Western blotting was used to detect the expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3. Results The proliferation inhibition rates of the positive control group and experimental group treated with different concentrations of sCD40L after 48 and 72 h was higher than that after 24 h (P<0.05). With the increase of sCD40L concentration, the proliferation inhibition rate of BJAB cells was increased in the experimental group. The cell percentage of G1phase increased both of the experimental group and positive control group, and the cell percentage of S phase decreased. In the experimental group, the cell percentage of G1phase in 6 g/mL subgroup was higher than that of 2, 4 g/mL subgroups, and the cell percentage of S phase was lower than that of 2, 4 g/mL subgroups (allP<0.05). The apoptosis rates of the experimental group and positive control group were higher than that of the control group (allP<0.05). In the experimental group, the apoptosis rate of 6 g/mL subgroup was lower than that of the positive control group (P<0.05). The relative expression of Caspase-3 and Bax protein in the experimental group and positive control group was higher than that in the blank control group, and the relative expression of Bcl-2 protein was lower than that of the control group (allP<0.05). ConclusionssCD40L can inhibit cell proliferation and induce apoptosis in BJAB cells, and the mechanism may be related to up-regulation of Bax, Caspase-3 protein expression, down-regulation of Bcl-2 protein expression and interfering with the cell cycle.

soluble CD40 ligand; B cells lymphoma; cell proliferation; cell cycle; apoptosis

贵州省科技合作计划项目(LH20157468)。

任明强(1977-)，男，副教授，硕士，主要研究方向为CD40L分子与血液病的关系。E-mail:844198637@qq.com

任明强

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.005

R733.4

A

1002-266X(2016)31-0016-04

2016-05-04)