整合素连接激酶抑制剂QLT0267对肾小管上皮细胞转分化的影响*

林智峰，贾林，赵丹，马莉，唐玉玲，杨锐，杨晓萍

（1.石河子大学医学院第一附属医院肾病科，新疆石河子832008；2.石河子大学医学院，新疆石河子832008）

整合素连接激酶抑制剂QLT0267对肾小管上皮细胞转分化的影响*

林智峰1，贾林2，赵丹1，马莉2，唐玉玲2，杨锐2，杨晓萍1

（1.石河子大学医学院第一附属医院肾病科，新疆石河子832008；2.石河子大学医学院，新疆石河子832008）

目的观察不同浓度整合素连接激酶（ILK）抑制剂QLT0267在高糖下诱导人近端肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（TEMT）的作用。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞，分为4组：对照组、高糖组、QLT0267组、高渗组，干预48h。逆转录聚合酶链式反应检测纤维粘连蛋白（FN）mR NA及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mR NA的表达，Western blot检测ILK、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化-蛋白激酶B（P-AKT）及α-SMA的表达，比较组间差异，探讨QLT0267对近端TEMT过程的影响。结果①30 mmol/L高糖可以上调人近端肾小管上皮细胞细胞中ILK、P-AKT、FN、α-SMA的表达。②30 mmol/L甘露醇不能引起人近端肾小管上皮细胞细胞中ILK、P-AKT、FN、α-SMA表达变化。③10μmol/L QLT0267抑制高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞细胞AKT、FN及α-SMA的mR NA和蛋白表达。结论①30 mmol/L葡萄糖可以诱导人近端TEMT。②QLT0267通过抑制人近端肾小管上皮细胞细胞中ILK下游AKT的活化，进而抑制FN及α-SMA的表达，10μmol/L QLT0267可以抑制人近端TEMT。

转分化；近端小管上皮细胞；整合素连接激酶；QLT0267

肾小管上皮细胞是一种稳定细胞，在生理情况下增殖不明显，但受到炎症、损伤等刺激时，会发生肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化（tubularepithelial-myofibroblasttransdifferentiation，TEMT），TEMT后的肌成纤维细胞（Myofibroblast，MyoF）具有分泌细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的能力，引起细胞外基质病理性沉积，打破肾间质中ECM生成与清除间的平衡，最终引发肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）。因此，寻找抑制TEMT过程的作用靶点对保护肾脏功能、延缓慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）进展至关重要。研究发现，糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）TEMT过程中整合素连接激酶（integrin-linked kinase，ILK）表达增高[1]，而正常情况下，肾小管上皮细胞中仅有少量ILK表达，据此估计ILK与TEMT关系密切。故本研究用ILK特异性抑制剂QLT0267，抑制ILK的活化，观察其在高糖下诱导TEMT的作用，探讨DN过程中TEMT的发病机制，为DN的临床治疗奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1主要材料与仪器

1.1.1实验材料HK-2细胞（上海通派公司），胎牛血清（fetal calf serum，FBS）（以色列BI公司），达尔伯克必需基本培养基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）（无糖）/F12培养基（美国Gibico公司），0.25%胰蛋白酶＋乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）（美国Heclon公司），噻唑蓝（北京Solarbio公司），QLT0267、二甲基亚砜（上海前尘生物科技有限公司，QLT0267溶剂），兔抗人ILK抗体（英国Abcam公司），兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）抗体（美国Cell Signaling公司），兔抗人磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B，P-AKT）抗体（美国Cell Signaling公司），鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（英国Abcam公司），多聚甲醛（武汉博士德生物公司），山羊血清（北京中杉金桥公司），Trizol（美国Invitrogen公司），Thermo逆转录试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.1.2实验仪器xMark酶联免疫检测仪（美国Bio-Rad公司），显微镜（日本Olympus公司），LSM 510 META共聚焦显微镜（德国ZEISS公司），XR+凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及分组①细胞培养：HK-2细胞购置于上海通派公司，复苏后用含10%FBS的DMEM（无糖）/F12培养液于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养，当细胞融合度达75%～80%时，用0.25%胰蛋白酶+EDTA消化，传代培养，取第2～7代细胞用于实验。②细胞分组：吕智美等[2]实验及本课题组前期研究均证实30 mmol/L葡萄糖可以诱导HK-2细胞转分化；LI等[3]报道，在HKC细胞中，1～10μmol/L QLT0267可以发挥有效的抑制作用。故本实验分为4组：对照组、高糖组（30 mmol/L葡萄糖）、QLT0267组（30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L QLT0267）、高渗组（30mmol/L甘露醇）作用48 h后，倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.2.2逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，R T-PCR）检测HK-2细胞中ILK、纤维粘连蛋白（Fibronectin，FN）、α-SMA的表达Trizol法提取细胞总RNA，测定HK-2细胞中总RNA含量及纯度。在逆转录酶催化下合成cDNA，以cDNA为模板进行扩增。FN正向引物：5'-CCTCACCAACCTCACTCCAG-3'，反向引物：5'-TCC CTCGGAACATCAGAAAC-3'，扩增产物117bp；α-SMA正向引物：5'-CCTGACTGAGCGTGGCTATT-3'，反向引物：5'-CAAGGGAGGTAGAGGTAGC-3'，扩增产物134bp；引物由上海生工生物工程有限公司合成，同时扩增管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参照组。α-SMA和FN扩增反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，59℃/60℃退火30s，72℃延伸30 s，共32个循环，72℃继续延伸5 min。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪中扫描采图，以各目的基因与GAPDH比值代表各目的基因的相对表达量。

1.2.3Westernblot检测HK-2细胞中AKT、P-AKT、α-SMA的表达取对数期细胞种板，按上述分组加药，干预48h后冰上裂解并收集细胞，4℃、12000r离心25 min，提取蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒测蛋白浓度，配平后加入5×loading buffer，混匀后100℃、8 min煮沸，蛋白变性，上样电泳，聚偏二氟乙烯膜转膜，5%脱脂奶粉或牛血清白蛋白室温封闭2h，使用兔抗人单克隆AKT、P-AKT抗体（1∶1 000）或鼠抗人单克隆α-SMA抗体（1∶500）4℃孵育过夜，二抗（1∶20 000）室温孵育2 h，暗室曝光，凝胶成像和Gel-Pro analyzer分析系统进行灰度分析。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1倒置相差显微镜下HK-2细胞形态学观察

对照组中，HK-2细胞为多边鹅卵石状，胞核居中，细胞间连接紧密，呈岛屿状生长；30 mmol/L葡萄糖使HK-2细胞逐渐由卵圆形、三角形向长梭型转变，细胞间紧密连接消失，失去原有极性；QLT0267组中，细胞数量较高糖组减少，细胞呈现长卵圆形，胞体略增大，可出现凋亡小体；高渗组中细胞形态较对照组无明显变化。见图1。

图1　倒置相差显微镜下HK-2细胞形态（×200）

2.2QLT0267干预48 h对HK-2细胞中ILK表达的影响

Western blot检测各组ILK表达水平，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=732.525，P=0.000），各组ILK表达水平有差异，对照组中可见ILK条带较细和弱，进一步两两比较结果，①高渗组ILK蛋白相对表达量与对照组比较，差异无统计学意义（t= 1.094，P=0.306）；②对照组与高糖组、QLT0267组ILK灰度比较，差异有统计学意义（t=47.580和29.428，P=0.000），高糖组、QLT0267组ILK灰度较对照组增高；③高糖组ILK表达量与QLT0267组比较，差异无统计学意义（t=1.162，P=0.279）。见图2。

图2　Western blot检测QLT0267干预48 h对各组HK-2细胞中ILK表达的影响

2.3QLT0267干预48h对HK-2细胞中AKT、PAKT表达的影响

Western blot检测各组AKT、P-AKT表达情况。4组AKT蛋白相对表达量比较，经单因素方差分析，差异无统计学意义（F=1.839，P=0.181）。各组P-AKT表达水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=590.355，P=0.000）。对照组中可见P-AKT条带较细和弱，进一步两两结果比较，①对照组P-AKT蛋白相对表达量与高渗组比较，差异无统计学意义（t= 1.584，P=0.152）；②对照组与高糖组、QLT0267组PAKT灰度比较，差异有统计学意义（t=47.580和21.293，P=0.000），高糖组、QLT0267组P-AKT灰度较对照组增高；③高糖组P-AKT表达量与QLT0267组比较，差异有统计学意义（t=4.748，P=0.003），QLT0267组P-AKT表达量较高糖组降低。见图3。

图3　Westernblot检测QLT0267干预48 h对各组HK-2细胞中AKT、P-AKT表达的影响

2.4QLT0267干预48 h对HK-2细胞中FN表达的影响

RT-PCT反应检测各组FN mRNA的表达，各组FN mRNA表达水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=227.047，P=0.000）。对照组中可见FN mRNA条带较细和浅，进一步两两结果比较，①对照组FN mRNA相对表达量与高渗组比较，差异无统计学意义（t=1.782，P=0.125）；②对照组与高糖组、QLT0267组FN mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（t=15.616和14.429，P=0.000），高糖组、QLT0267组FN mRNA相对表达量较对照组增高；③高糖组FN mRNA相对表达量与QLT0267组比较，差异有统计学意义（t=9.447，P=0.002），QLT0267组FN mRNA相对表达量较高糖组降低。见图4。

图4　RT-PCR反应检测QLT0267干预48 h对各组HK-2细胞中FN表达的影响

2.5QLT0267干预48 h对HK-2细胞中α-SMA mRNA表达的影响

RT-PCR反应检测各组中α-SMA的表达，各组α-SMA mRNA表达水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=40.715，P=0.001）。对照组中可见α-SMA mRNA条带较细和浅，进一步两两结果比较，①对照组α-SMA mRNA相对表达量与高渗组比较，差异无统计学意义（t=0.265，P=0.800）；②对照组与高糖组、QLT0267组α-SMA mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（t=10.844和4.270，P= 0.001和0.005），高糖组、QLT0267组α-SMA mRNA相对表达量较对照组增高；③高糖组α-SMA mRNA相对表达量与QLT0267组比较，差异有统计学意义（t=5.987，P=0.001），QLT0267组α-SMA mRNA相对表达量较高糖组降低。见图5。

2.6QLT0267干预48 h对HK-2细胞中α-SMA表达的影响

Western blot检测各组中α-SMA的表达。各组α-SMA蛋白相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=869.841，P=0.000）。对照组中可见α-SMA条带较细和浅，进一步两两结果比较，①对照组α-SMA蛋白相对表达量与高渗组比较，差异无统计学意义（t=1.747，P=0.119）；②对照组与高糖组、QLT0267组α-SMA蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（t=46.042和18.585，P=0.000），高糖组、QLT0267组α-SMA蛋白相对表达量较对照组增高；③高糖组α-SMA蛋白相对表达量与QLT0267组比较，差异有统计学意义（t=19.244，P= 0.000），QLT0267组α-SMA蛋白相对表达量较高糖组降低。见图6。

图5　RT-PCR反应检测QLT0267干预48 h对各组HK-2细胞中α-SMA表达的影响

图6　Westernblot检测QLT0267干预48 h对各组HK-2细胞中α-SMA表达的影响

3 讨论

近年来，随着对DN过程中RIF研究的不断深入，TEMT在CKD发展为终末期肾脏疾病过程中的作用受到广泛关注。研究发现，DN病程发展过程中，高糖可以通过活化TGF-β信号通路诱导TEMT，其特征为肾小管上皮细胞原有表型特征丧失，失去其原有黏附特性，转化为表达α-SMA的MyoF，而α-SMA的出现是TEMT开始的标志[4]，其表达量与TEMT严重程度密切相关[5]。本研究证实，30mmol/L葡萄糖作用48h，可使HK-2中α-SMA表达增高，然而30mmol/L葡萄糖亦是高渗溶液，因此设置30 mmol/L甘露醇组，以鉴别在TEMT过程中，渗透压增高是否也是诱导HK-2细胞转分化的独立因素。实验结果证实，30 mmol/L甘露醇作用48 h不能使HK-2细胞中α-SMA表达增高，与GU等[6]研究结果基本一致。在该过程中，ILK在高糖组中表达亦增高，佐证ILK可能与DN过程中TEMT关系密切。

ILK是细胞基质粘连的核心组成部分和整合功能的重要调节器[7]，参与细胞黏附、细胞形态变化、调节细胞外基质沉积等多种病理、生理过程[8-9]，如激活和维持静态毛囊干细胞稳定、防止阻止癌变、抑制乳腺癌干细胞的生长等[10-11]。在肾脏中，高糖可能可以通过引起ILK高表达，诱发足细胞、HK-2细胞转分化，而大黄酸可能通过下调ILK，延缓该疾病过程[12-13]。因此，寻找有效阻断ILK信号通路的医药制剂对延缓TEMT过程至关重要。

QLT0267是目前公认的ILK特异性抑制剂，通过抑制ILK下游AKT（ser473）磷酸化起效[14]，不改变ILK的表达量，与本研究结果一致。其可能机制为：①P-AKT表达量降低，可以直接抑制细胞分裂、增生；②P-AKT表达下降可以激活糖原合酶激酶3，降低β-链结素/T细胞转录因子的转录活性，抑制细胞增生[14]。在体内QLT0267可以抑制肿瘤细胞生长，抑制瘢痕形成，降低糖尿病大鼠尿白蛋白/肌酐比值[15-18]，参与多种病理生理过程。那么QLT0267在TEMT过程中是否也能起到保护作用呢？

众所周知，正常情况下，ECM在维持肾脏结构与功能、细胞生长与分化过程中起着非常重要的作用，处于不断更新和降解的动态平衡中。TEMT后ECM在肾间质内过度集聚，引起RIF。ECM的主要成分是Ⅰ型、Ⅲ型胶原、FN及层黏蛋白等，因此，FN与ILK介导的TEMT关系密切。本研究结果证实，高糖诱导ILK表达增高的同时亦上调FN mRNA，与笔者前期报道内容一致[18]，同时本研究还发现，FN与α-SMA同步表达，即在对照组、高渗组中少量表达，在高糖组中表达量均显著升高，10μmol/L QLT0267在抑制ILK下游AKT活化的同时，下调FN和α-SMA的表达，证实QLT0267在抑制TEMT的疾病过程具有一定的治疗效果。

综上所述，10μmol/L QLT0267可通过特异性阻止ILK下游蛋白AKT的活化，下调高糖诱导TEMT过程中FN和α-SMA的表达量，延缓TEMT的发展进程，达到一定的治疗效果。

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（童颖丹编辑）

Effect of integrin-linked kinase inhibitor QLT0267 on tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation of HK-2 cells*

Zhi-feng Lin1，Lin Jia2，Dan Zhao1，Li Ma2，Yu-ling Tang2，Rui Yang2，Xiao-ping Yang1
（1.Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Medical College，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832008，China 2.Medical College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832008，China）

Objective To observe the effect of different concentrations of an inhibitor of integrin-linked kinase（ILK）QLT0267 in process of high glucose-induced tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation（TEMT）.Methods The cultured human renal tubular epithelial cells（HK-2）were divided into control group，high-glucose group，QLT0267 group and D-mannitol group，and cultured for 48 hours.RT-PCR was used to test the expressions of fibronectin（FN）mRNA and α-smooth muscle actin（α-SMA）mRNA.The ILK，AKT，p-AKT and α-SMA protein expressions were detected by Western blot.The differences among the groups were observed，and then the role of QLT0267 in the process of TEMT was explored.Results The expressions ofp-AKT，ILK，FN and α-SMA in the HK-2 cells were up-regulated after 30 mmol/L glucose intervention for 48 h.However，30 mmol/L D-mannitol did not change the expression of p-AKT，ILK，FN or α-SMA in the HK-2 cells after 48 h.QLT0267 at a concentration of 10 μmol/L inhibited the mRNA and protein expressions of AKT，FN and α-SMA in the high glucose-induced HK-2 cells.Conclusions Glucose can lead toTEMT in HK-2 cells at a concentration of 30 mmol/L，while 30 mmol/L D-mannitol can not.QLT0267 can prevent activation of AKT in the downstream of ILK，thereby reduce the expression of FN and α-SMA and delay the process of TEMT in the HK-2 cells at concentration of 10 μmol/L.

epithelial-mesenchymal transition；kidney tubular epithelial cell；integrin-linkedkinase；QLT0267

R 692

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.008

1005-8982（2016）17-0039-06

2015-12-29

石河子大学科学技术研究发展计划基金（No：2013ZRKXYQ-YD16）