木薯DBE和SBE基因的序列分析及其茉莉酸甲酯诱导表达特性

丛汉卿 龙娅丽 齐尧尧 张振文 陈松笔 乔飞

摘 要 为研究木薯中调控支链淀粉合成的DBE和SBE基因如何被茉莉酸信号调控，首先对木薯基因组数据库中的MeDBE和MeSBE2.1基因进行序列分析，二者都具有α淀粉酶催化结构域且启动子区都具有茉莉酸响应元件等多种响应元件。以木薯品种‘华南八号悬浮培养细胞为材料，利用qRT-PCR检测木薯MeDBE和MeSBE2.1基因在茉莉酸甲酯处理后的表达特性。结果显示：MeDBE基因的表达在最初短暂上调后持续下调，而MeSBE2.1则持续上调后又恢复最初水平，说明MeDBE和MeSBE2.1基因可被茉莉酸信号调控，进一步推测表明，其受到不同激素信号整合后的综合调控，以影响支链淀粉的生物合成。

关键词 木薯 ；DBE基因 ；SBE基因 ；茉莉酸 ；表达分析

中图分类号 S533 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.010

木薯（Manihot esculenta Crantz） 屬大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot Miller）植物，原产热带南美洲[1]，是世界三大薯类作物之一，也是第六大粮食作物，具有重要的食用和工业价值。木薯作为一种高光效、高淀粉含量和高水分利用率的热带作物，研究其淀粉合成过程并进一步改善其品质，具有重要的科学和经济价值。

在高等植物中，淀粉是储藏碳水化合物的主要形式，一般由直链淀粉和支链淀粉2种葡萄糖多聚体组成。直链淀粉主要由颗粒结合的淀粉合成酶 （Granule-bound starch synthase， GBSS） 催化合成[2]，而支链淀粉的合成非常复杂，在可溶性淀粉合成酶 （Soluble starch synthase， SSS） 的作用下通过α-1，4糖苷键进行葡聚糖链的延伸达到一定长度后，在淀粉分支酶 （Starch branching enzyme， SBE） 作用下，在线性糖链的内部引入α-1，6糖苷键形成分支，并进一步在SSS催化下延长分支，最后淀粉去分支酶（Starch debranching enzyme， DBE）对分支进行修饰，最终合成具有一定结构特性的淀粉结晶体[2]。植物中DBE和SBE都有多种同工酶。根据系统进化关系SBE可以分为SBEI和SBEII 2种类型，它们不仅结构有差异，而且作用于特异的底物：SBEI倾向作用于直链淀粉，主要催化转移相对较长的多糖链，而SBEII倾向作用于支链淀粉，催化转移较短的多糖链[3]。DBE同样存在2种类型，一种为水解普鲁蓝（Pullulan）和极限糊精的α-1，6糖苷键的普鲁蓝酶或称极限糊精酶（Pullulanase；Limit dextirnase），但对糖原和变性支链淀粉的α-1，6糖苷键无活性或弱活性；另一种为以变性支链淀粉、糖原和支链淀粉类似物为底物，催化α-1，6糖苷键的水解的异淀粉酶（Isoamylase），但不能水解普鲁蓝。

茉莉酸（jasmonic acid， JA）是植物逆境响应的信号分子，在涉及植物对生物性和非生物性逆境胁迫和植物生长发育过程中的基因调控上发挥着重要的作用。JA作为一种逆境信号转导信号，具有对非生物胁迫反应的功能[4-5]。江月玲和潘瑞炽[6]发现，不同浓度茉莉酸甲酯处理后，花生幼苗中的淀粉、还原糖和可溶性糖降低。Sarkar[7]发现，在离体条件下，茉莉酸甲酯与马铃薯块茎中淀粉的积累相关，胁迫信号可直接影响到淀粉合成酶的活性，并会使淀粉的结构发生改变[8-10]。然而，相关分子机制迄今尚不清楚，为进一步探索茉莉酸信号如何影响木薯淀粉的生物合成，本研究选取了木薯DBE和SBE基因，初步研究其受茉莉酸信号的影响情况。于JGI的木薯基因组数据库v6.1中获得淀粉去分支酶DBE基因序列MeDBE（Manes.05G073400）[11]，和一个淀粉分支酶MeSBE2.1（Manes.09G059400）同时进行分析[12]。生物信息学分析发现MeDBE启动子区具有一个茉莉酸响应元件；MeSBE2.1具有2个茉莉酸响应元件。同时利用木薯悬浮培养细胞对其茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）诱导表达特性分析中也发现，MeDBE和MeSBE2.1基因可受JA信号调控，并呈现不同的表达趋势。本研究旨在通过序列分析和表达分析，确定JA信号能对MeDBE和MeSBE基因表达造成影响，并探索表达变化特性及其机制，为进一步研究逆境信号通过MeDBE和MeSBE在木薯支链淀粉合成过程中所发挥的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

木薯品种‘华南八号（‘SC8） 悬浮培养细胞，该细胞通过叶片愈伤组织建立。现保存于中国热带农业科学研究院热带作物品种资源研究所。吸取处于指数增长期的悬浮培养细胞1 mL于离心管中并置于摇床25℃稳定 30 min，分为2组并分别以浓度400 μL/L茉莉酸甲酯（Sigma-Aldrich） 处理，另一组不进行任何处理作为对照。选取0 h未处理和处理后0.5、1、2、4、8 h共6个时间点的样品，微离心后弃上清液氮速冻-80℃冰箱保存。此步骤重复3次，获得3批生物学重复。

1.2 方法

1.2.1 SBE和DBE基因及启动子区序列分析

使用JGI的木薯基因组数据库（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias=Org_Mesculenta_er）获得MeDBE及MeSBE_2的CDS序列（coding sequence）和DNA序列（genomic sequence）[11]。用Spidey（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/）和NetGene2 V2.4（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/）分析基因结构[13-14]。用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）分析内含子相位[15]。用TSSP（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter）分析转录起始位点[16]，用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）综合分析启动子区序列，寻找顺势作用元件位点[17]。

1.2.2 SBE和DBE基因的蛋白分析

使用BLAST工具对预测的氨基酸序列进行比对分析，用PortParam（http：//web.expasy.org/protparam/）预测其蛋白分子量和等电点[18]，使用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）预测结构域[19]。用TMHMM Server在线工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行跨膜区预测[20]，使用SubLoc（http：//www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/）和WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）进行蛋白亚细胞定位预测[21-22]。使用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽[23]。使用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）预测二级结构[24]。利用Swiss-model（http：//swissmodel.expasy.org/）预测三维结构[25]。使用PFP（http：//kiharalab.org/web/pfp.php）预测蛋白功能[26]。

1.2.3 序列比对和进化树分析

鉴于Pei等已对木薯SBE基因家族进行了系统进化关系分析[17]，故本研究只对DBE基因做进化树分析，选取了与木薯DBE蛋白序列同源性较高的13种其它作物DBE蛋白序列共同进行进化树分析，它们分别来自：蓖麻（Ricinus communis，XP_002533079.1）、可可（Theobroma cacao，XP_007050677.1）、野生大豆（Glycine soja，KHN19871.1）、马铃薯（Solanum tuberosum，NP_001274804.1）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，XP_013449701.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，NP_171830.1）、豌豆（Pisum sativum，AAZ81836.1）、樹棉（Gossypium arboreum，KHG10947.1）、玉米（Zea mays，ACG48178.1）、籽粒苋（Amaranthus cruentus，BAQ22171.1）、小麦（Triticum aestivum，AEV92948.1）、水稻（Oryza sativa，BAD

19754.1）、大麦（Hordeum vulgare，BAD89532.1）。使用MEGA6对其氨基酸进行序列比对，并构建邻接（neighbor-joining，N-J）聚类进化树，使用bootstrap方法1 000次重复对进化树进行验证。

1.2.4 诱导表达的qRT-PCR检测

使用Axygen 总RNA小量制备试剂盒（Axygen）提取总RNA；使用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase 反转录试剂盒（Takara）合成cDNA；使用SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）实时定量试剂盒（Takara）进行qRT-PCR；以检测DBE和SBE基因在悬浮培养细胞中受茉莉酸甲酯诱导表达情况，所有的qRT-PCR反应均来自同一批反转录的cDNA产物，18S rRNA为内参。所用目的基因及18s rRNA的引物为Primer premier 5.0软件设计，序列如表1。

2 结果与分析

2.1 基因结构分析

基因结构分析发现，MeDBE基因仅有一个外显子，无内含子存在，而MeSBE2.1具有22个外显子（图1）。转录起始位点预测显示：MeDBE基因的转录起始位点位于起始密码子上游565 bp处，而MeSBE2.1基因的转录起始位点位于起始密码子上游457 bp处。顺势作用元件位点分析发现：MeDBE基因启动子区域包含2个茉莉酸响应元件和1个乙烯响应元件ERE，同时，还有可受缺氧环境诱导的ARE元件及受高温诱导的HSE和受低温诱导的LTR；而MeSBE2.1也有2个可受茉莉酸诱导的元件CGTCA-motif和TGACG-motif，此外，还有1个可受脱落酸（abscisic acid，ABA）诱导的ABRE、1个可受赤霉素（gibberellin，GA）诱导的GARE-motif和1个可受水杨酸（salicylic acid，SA）诱导的TCA-element（表2）。

2.2 蛋白分析

MeDBE有883个氨基酸，分子量为99.057 3 ku，理论等电点为5.73。MeSBE2.1有827个氨基酸，分子量为94.851 4 ku，理论等电点为5.72。跨膜区分析显示，2个蛋白可能无跨膜结构。亚细胞定位预测表明，2个蛋白都可能定位在叶绿体上。信号肽分析发现，二者无明显的信号肽结构。二级结构预测，MeDBE有12个螺旋结构和31个折叠结构，MeSBE2.1则有14个螺旋结构和28个折叠结构，可参考其三维预测结构（图2）。MeDBE具有DBE典型的保守结构域，如AmyAc_plant_IsoA、E_set_GDE_Isoamylase_N、glgX_debranch等；而MeSBE2.1具有SBE典型的保守结构域，如AmyAc_bac_euk_BE、E_set_GBE_euk_N、Alpha-amylase_C等。蛋白功能预测显示：MeDBE和MeSBE2.1基因皆最符合Gene Ontology（GO）中的GO：0003824条目，具有催化酶活性。

2.3 基因进化树分析

通过序列比对发现，本实验中的DBE是以变性支链淀粉、糖原和支链淀粉类似物为底物的异淀粉酶。从进化树可以看出，同一科植物的DBE基因基本聚为一类，木薯作为大戟科植物，与同一科的蓖麻处于相同分支（图3）；豌豆、野生大豆、蒺藜苜蓿3种豆科植物处于同一分支；大麦、小麦和水稻作为禾本科植物同处一分支，且连同苋科的籽粒苋4种作物处于一个独立的大分支上。较为有趣的是，梧桐科的可可和锦葵科的树棉处于同一分支；且禾本科的玉米并没有与其它3 种禾本科作物在另一大分支上；其余作物都单独分支。另外研究已知，MeSBE2.1和MeSBE2.2与蓖麻等作物SBEII有很高的同源性，可归于双子叶SBEII家族[12]。

2.4 茉莉酸甲酯诱导的MeDBE和MeSBE2.1表达水平变化

MeDBE在MeJA处理0.5 h后先上升到本底水平的1.5倍，后持续下降，到8 h时已降到接近只有本底水平一半（图4）。而MeSBE2.1在MeJA处理0.5 h后表达量出现了约1.4倍的上升，并在4 h处继续上升达到高于3倍后，又在8 h快速下降至最初水平。可以看出，MeDBE和MeSBE2.1呈现出较大差异，二者在处理0.5 h内都呈现出略微上调，但之后MeDBE表达继续上升后又下降，总体呈现先上升后下降的趋势，而MeSBE2.1则呈现出持续下调。鉴于前面的启动子区分析中，两基因都有茉莉酸响应元件，可能是造成0.5 h之内上调的原因，而后期二者完全不同的表达趋势，则说明必然有其它的调控途径的参与。

3 讨论与结论

有学者认为，SSS和SBE的相互作用影响了淀粉的分支频率和链长[27]。虽然有观点认为，SBE和DBE能直接催化淀粉分子中分枝链的形成或去除，但这2个酶可能只影响支链淀粉的精细结构，而不影响支链淀粉占总淀粉的比例[28]。但大量实验证实，DBE和SBE功能的缺失将严重影响淀粉颗粒的形成和支链淀粉的比例。如拟南芥中DBE1基因的突变限制了叶内淀粉的正常积累，水稻中DBE同工的su1基因突变后会产生畸形淀粉粒[29]。而SBE的缺失则导致如豌豆、玉米、小麦和马铃薯植株中极高的直链淀粉含量且淀粉颗粒的形态和组成均有改变[30]。这些结果都表明，DBE和SBE基因的变化改变了支链淀粉的生物合成过程。

MeJA处理后，2个基因各自呈现出不同的响应趋势，表明虽同为逆境信号物质，却对2个基因有不同的调控作用。在启动子区元件分析时已知，MeDBE和MeSBE2.1都具有茉莉酸响应元件，这在一定程度上说明了为何MeJA处理后这2个基因在0.5 h内出现了一定程度的上调；Pei等[12]在研究木薯MeSBE家族基因在不同胁迫条件下的表达特性时，选择了5、15 min，0.5、1、2 h共5个时间点，其中MeSBE2.1在MeJA处理后的2 h内呈持续上升趋势，而本试验中，MeSBE2.1前期表现类似并且表达水平在4 h达到最高点后开始下降，并在8 h降至本底水平附近。植物在接受外源信号后上调相关基因表达时，往往呈现先上升后下降的特点。因为上调后基因产物开始积累，达到满足自身需求的数量或浓度后，上调停止，开始逐渐降低，这一现象在植物中极为普遍。而MeDBE表达量维持上调的时间更短，在0.5 h之后便开始下行。说明茉莉酸响应元件的作用并不持久，其表达量会被其它调控方式下调。总而言之，直接施加MeJA无法长时间维持MeDBE和MeSBE2.1长期的高表达，进而调控木薯支链淀粉合成。

另外，MeDBE表达量在0.5 h后的持续下调说明，在其上游的茉莉酸响应元件发挥作用引起上调后，应存在其它负调控机制导致上调趋势被扭转，其具体机制还需进一步探索。本研究已知，MeDBE和MeSBE2.1的启动子区还有一些各自独有的其它调控元件，如赤霉素、脱落酸、水杨酸等响应元件。同时，鉴于2个基因的启动子区具有大量受逆境信号调控的元件，说明多种胁迫都可以调控这2种酶的表达。植物中茉莉酸与其它信号转导通路间的激素的交叉相互作用在整个生活周期内、不同组织器官间、不同类型细胞中一直存在。不同激素信号的整合共同介导了植物的生长发育、对环境的反应及衰老死亡。茉莉酸、水杨酸和乙烯之间存在着复杂的相互作用，既协作又对抗[31]，如乙烯和茉莉酸具有协同作用，而水杨酸对茉莉酸有拮抗作用。鉴于MeSBE2.1同时具有茉莉酸响应元件和乙烯响应元件，而MeDBE则同时具有茉莉酸响应元件和水杨酸响应元件，2个基因后期表达趋势的差异可能源于不同信号的综合作用。鉴于调控方式的复杂性，推测2种不同逆境信号施加后可与其它不同激素综合作用，产生了迥异的调控模式，最终造成MeDBE和MeSBE2.1基因不同的表达特性。同时，因为DBE和SBE基因可以影响淀粉积累、直链淀粉的比例以及淀粉颗粒的形态和组成[29-30]，推测茉莉酸作为一种逆境信号，如长期施加，可能通过影响这2个基因的表达进而影响到植物淀粉的积累。

作为重要的粮食作物及工業酒精和淀粉来源，木薯淀粉的合成具有重要的科研意义和经济价值，DBE和SBE作为控制支链淀粉合成的重要基因，研究逆境信号如何对其造成影响并探索相关机制，有助于更好地理解木薯淀粉合成的分子机制，对木薯淀粉品质改良具有重要意义，并为培育出品质更高的新品种奠定基础。目前仅知木薯的MeDBE和MeSBE2.1和茉莉酸信号影响后的表达特性，但具体的信号转导路径和调控机理，仍需进一步探索和验证。

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