锯叶棕体细胞胚胎发生及植株再生体系的建立

彭欣怡 程琴 黄秋伟 李慧敏 王丽萍

摘 要 从锯叶棕成熟种子中成功实现体细胞胚胎发生和植株再生。成熟种子放在MS培养基上培养，加入0.15%活性炭，452 μmol/L 2，4-D和14.7 μmol/L N6-2iP，所有成熟合子胚培养5周后长出体胚簇，12周后，外植体转移到2，4-D浓度减到90.4 μmol/L的MS培养基中进行体胚增殖，之后体胚转移到含有0.9， 9 μmol/L TDZ或没有生长调节剂的基本培养基中转化成小植株。9 μmol/L TDZ对植株再生是无效的，然而，在0.9 μmol/L TDZ中作次培养有12%胚胎能长成完整植株，没有生长调节剂中35%胚胎长出嫩枝，这些嫩枝转移到含有22.2 μmol/L NAA的培养基中全部都会生根。picloram和2，4-D对锯叶棕幼苗愈伤的诱导效果最佳，6-BA次之，对子叶来说，picloram和2，4-D对愈伤的诱导起不到任何作用，而对茎尖的诱导效果最好。

关键词 离体培养 ；锯叶棕 ；体细胞胚胎 ；愈伤诱导

中图分类号 S792.91 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.011

锯叶棕[Serenoa repens（bartram）small]，又名锯棕叶或锯棕榈，学名“沙巴棕”，属于棕榈科灌木植物，主要生长在佛罗里达州以及南北美洲的气候炎热地区[1]。锯叶棕是最理想的景观植物，它是一种坚韧，低维护的绿色植物，其生长少受水分胁迫及植物病害和虫害的影响[2]。其成熟的干燥果实可供药用，近年来发现其提取物治疗良性前列腺增生（BPH）和下尿路（LUTS）症状效果显著，现已成为最有效的3种治疗BPH植物药物之一[3-4]。锯叶棕作为草药制剂价值连城，受欢迎程度也正在日益增长。

锯叶棕通过传统种子繁育存在一定的局限性[5]，自然萌发需4～6个月，幼苗生长缓慢，一般需要2～6年[6]，将种子繁育温度提高到35℃，萌发时间缩短至约1个月[5]，然而，很少人清楚锯叶棕在自然条件下的最佳生长和结果条件。

植物组织培养是植物快速繁育的重要技术手段，通过组织培养可以大规模繁育基因优良物种，进行种质资源保护，也可以进行遗传转化实验。国内尚无锯叶棕组织培养的报道。本研究的宗旨是为了发展锯叶棕体外再生的组织培养体系，以期为快速繁育国内优良稀缺植物资源提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

广西亚热带作物研究所与美国加州湾食品科技公司合作引种、试种生长10年的锯叶棕种子[7]。

1.2 方法

1.2.1 外植体准备

将收获放置在阴暗干燥环境下保存1年的种子，剥去果皮和种皮，在超净台上用无菌水洗1遍，再用0.1% 升汞摇晃消毒8 min，去掉消毒液，用无菌水冲洗3遍，每次5 min。将消毒好的种子用枝剪进行横切和纵切，露出种子凝胶状的胚乳和圆锥形的胚。1粒种子1个培养皿。

1.2.2 培养基及培养条件

用1.0 mol/L NaOH 将全部培养基pH值调节 为5.8，121℃高压灭菌20 min。根据不同试验在基础培养基中添加不同种类和浓度的激素，26℃黑暗培养。锯叶棕体胚再生培养基和愈伤组织诱导培养基见表1。

1.2.3 愈伤组织的诱导

选取已经萌发成苗的小植株的茎尖、根尖及侧根、子叶等部位以及胚簇进行愈伤组织的诱导，并设置不同激素进行实验，26℃暗培养40 d，观察愈伤组织分化情况，比较愈伤组织诱导的结果，以确定根系外植体的最佳部位。

2 结果与分析

2.1 体细胞胚胎发生与植株再生

机械破损处理能大幅度提高锯叶棕发芽率，发芽率可达到90%，机械破损处理是锯叶棕最有效的促芽方式[11]，用枝剪进行横切和纵切，露出种胚以提高种子的萌发率。将处理好的种子每6周转接一次新鲜MS1培养基（图1a）。12周后，外植体转移到2，4-D浓度减到90.4 μmol/L的MS2培养基中增殖，每个原始合子胚增殖为大约200个体细胞胚胎（图1b），在35周内，增殖会继续，但在此培养基上培养不能再维持。

将体细胞胚胎分别转移到TDZ浓度为0，0.9和9 μmol/L 的MS3培养基中进行诱导培养，培养条件为25℃，光照16 h/d（图1c）。每个处理用100个体细胞胚胎实验，在TDZ为0的培养条件下，35%的胚胎长出嫩芽，但不长根；在0.9 μmol/L TDZ的培养中有12%的胚胎产生芽与初级根（图1d），在含有9 μmol/L TDZ培养基中既不出芽也不生根。没有生长调节剂和含有0.9 μmol/L TDZ培養基中诱导得到的小苗转移到含有22.2 μmol/L NAA的MS4培养基中诱导生根，培养8周后，所有的47株外植体都能产生初级根和次生根（图1e）。

2.2 体胚愈伤组织诱导

棕榈科植物诱导愈伤难，时间长，但近期报道从油棕未成熟雄性花序成功诱导愈伤，其中加有激素picloram的愈伤诱导率为82%，萘乙酸的诱导率为54%[10]。铁皮石斛已经建立了一个高效愈伤诱导率的体系，将原球茎片段放在1/2 MS培养基上，辅有NAA，6-BA，2，4-D等激素，其中以8.8 μmol/L 6-BA的培养基中愈伤诱导率最高[9]。综合以上信息，采用愈伤诱导培养基对已经萌发成苗的小植株的茎尖、根尖及侧根、子叶等部位以及胚簇进行愈伤组织的诱导，结果显示（表2），子叶和茎尖部位可以形成愈伤，根部和刚萌发出的体胚不能形成愈伤组织。picloram和2，4-D诱导茎尖效果最好，6-BA次之，picloram和2，4-D对子叶愈伤组织诱导无效，结果表明，茎尖是锯叶棕最佳的愈伤诱导材料。

3 讨论

锯叶棕跟其他棕榈一样，是多年生木本单子叶植物，未成熟合子胚是胚胎发生最好的外植体。但本试验利用的是成熟的种子，体胚的形成也只需约1.5月。油棕成熟合子胚添加450 μmol/L picloram和2.5 g/L活性炭的胚性愈伤组织诱导率可以达到97.5%[10]。活性炭由于其能吸附芳香族化合物，因此可以吸附酚类物质，使多酚氧化酶和过氧化物酶失活[12]，此特性在棕榈组织培养中降低外植体的褐化、增强再生方面起到非常重要的作用[13]。因此，棕榈组培中加活性炭是常见的方法[14]。不加活性炭的培养基，氧化性太高，所有的合子胚都褐化而不能萌发，一旦加有活性炭，没有氧化和酶类积累，在2周内胚可以膨大到原来体积的4倍。5周后所有的外植体开始长出半透明的胚簇。由于活性炭也可以吸附植物生长调节因子，它也可能对组培产生负面影响。通过放射性示踪剂显示，100 μmol/L 2，4-D在5 d内被0.25%的活性炭吸附掉99.5%[15]，然而，本试验使用半固体培养基、减少活性炭浓度和增加2，4-D浓度可以增加2，4-D可利用率。虽然还不清楚在含有0.15%活性炭的半固体培养基中，452 μmol/L 2，4-D可利用的准确百分比，但是这些培养条件大大增加了自由2，4-D的数量，这样就有足够的可利用2，4-D来诱导胚胎发生。

棕榈植物主要用种子进行繁殖，棕榈植物的种子播种后发芽难，发芽时间长，出苗不整齐是其特点，也是生产中的难点[16]。幼苗的愈伤诱导中，茎尖是最好的诱导材料，2，4-D和picloram是最佳的激素诱导剂，但在实验中发现，从1粒种子诱导出的愈伤组织只分化成2～3株小苗，从接种到分化成苗，花时间半年有余，还达不到扩大数量的目的，所花时间、物力和人力也不少，所以在短期内用少量珍稀珍贵的引种品种，进行大量繁殖推广较难，后续工作还需进一步研究。

4 小结

本研究中，锯叶棕不经过愈伤过程直接再生，可以维护外植体来源的完整性，体细胞无性系变异较少，因此，这种再生体系更有利于繁殖棕榈独特基因型和种质资源保护。更多的研究旨在考察不同生长调节剂组合，以及不同基因型的响应，以便建立锯叶棕最优的体外再生系统。

参考文献

[1] 林有润. 观赏棕榈[M]. 哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，2003.

[2] Tanner G W， Mullahey J J， Maehr D. Saw-palmetto： an ecologically and economically important native palm[M]. Florida Cooperative Extension Service， IFAS，University of Florida， 1996.

[3] 王 萍，马子龙，刘立云. 锯叶棕的药用价值及市场前景分析[J]. 中国热带农业，2007（3）：41-42.

[4] Taofikat B A， Max H P，Barbara W，et al. Serenoa repens （Saw Palmetto）A Systematic Review of Adverse Events[J]. Drug Safety， 2009， 32 （8）： 637-647.

[5] Gallo-Meagher M， Green J. Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of saw palmetto， an important landscape and medicinal plant[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2002， 68： 253-256.

[6] 何洁英. 棕榈科植物种子繁殖及移栽技术初探[J]. 广东园林，1998（1）：26-27.

[7] 周全光，黄锦媛，黄丽君. 美国锯叶棕的引进与适应性观测[J]. 广西热带农业，2007（5）：21-22.

[8] Dias A C， Guerra M P， Cordoba A S，et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration in the tissue culture of Geonoma gamiova（Arecaceae）. Acta Hort，1994， 360： 167-171.

[9] Zhao P， Wu F， Feng F S， et al. Protocorm-like body （PLB） formation and plant regeneration from the callus culture of Dendrobium candidum， Wall ex， Lindl[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 2008， 44（3）： 178-185.

[10] Talita A B， Zanderluce G L， Jonny E S P. New approaches to improve the efficiency of somatic embryogenesis in oil palm （Elaeis guineensis Jacq.） from mature zygotic embryos.In Vitro Cellular Developmental Biology Plant， 2013， 49： 41-50.

[11] 尚秀華，谢耀坚，张沛健，等. 药用植物锯叶棕种子萌发条件初探[J]. 种子，2014，33：70-73.

[12] Pan M J， van S J. The use of charcoal in in vitro culture-A review[M]. Plant Growth， 1998， 26： 155-163.

[13] Tisserat B. Date palm[M]//Sharp W R， Evans D A， Ammirato P V. Handbook of Plant Cell Culture. New York： Macmillan Publishing Company， 1984（2）： 505-545.

[14] Veramendi J， Navarro L. Influence of physical conditions of nutrient medium and sucrose on somatic embryogenesis of date palm. Plant Cell Tiss. Org. Cult， 1996， 45： 159-164.

[15] Ebert A， Taylor F ，Blake J. Changes of 6-benzylaminopurine and 2，4-dichlorophenoxyacetic acid concentrations in plant tissue culture media in the presence of activated charcoal[J]. Plant Cell， Tiss. Org. Cult， 1993， 33： 157-162.

[16] 何洁英. 棕榈植物种子贮藏和繁殖研究[J]. 广东园林，2002（3）：37-40.