巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆和表达分析

肖小虎 隋金蕾 戚继艳 阳江华 秦云霞 唐朝荣

摘 要 以拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列为探针，对橡胶树转录组数据库进行搜索，并设计引物进行PCR扩增，得到7个橡胶树钙调蛋白基因的cDNA序列，命名为HbCaM1-7。序列分析结果发现，HbCaM1-7的CDS序列均为450 bp，编码149个氨基酸，分子量为16.8 ku，等电点为3.95。其中，HbCaM1-6间氨基酸同源性为100%，HbCaM7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%。在基因结构组织方面，HbCaM1-7均为一个内含子，且内含子的插入位置相同，但内含子的长度明显不同。从氨基酸序列同源性和进化关系分析结果可看出，钙调蛋白基因家族在进化上非常保守。在表达方面，HbCaM1-6在各组织中均有表达，除了HbCaM3在根中表达丰度相对较高，其他成员均在胶乳中表达丰度相对较高，而HbCaM7在各组织中的表达均比较低；乙烯利处理后，HbCaM2-7的表达均有一定的上升趋势，而在叶片发育过程中HbCaM1-5圴呈明显下调表达。由此可见，橡胶树钙调蛋白与橡胶树叶片发育、胶乳乙烯信号通路具有一定的相关性。

关键词 巴西橡胶树 ；钙调蛋白 ；基因克隆 ；基因家族 ；表达分析

中图分类号 S794.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.009

在植物生长发育的过程中，钙离子作为第二信使扮演着至关重要的角色。钙调蛋白（Calmodulin，CaM）是一类存在于动植物真核细胞内和钙离子相结合的小分子蛋白[1]，也是生物细胞内功能和分布最广泛的高度保守的蛋白之一[2]。钙调蛋白有4个Ca+结合域，多数CaM氨基酸序列的长度为148个，细胞内钙离子浓度升高，使钙调蛋白的钙离子结合位點被占据，因而改变了其构象，并促进其与细胞内靶酶的结合，由此改变细胞内的代谢活动。由于钙调蛋白重要的调控功能引起了人们的重视，钙调蛋白基因在动物[3-4]、真菌[5]和原生动物[6]中都已被分离和克隆。在植物界，迄今为止已成功克隆了拟南芥[7]、水稻[8]、大麦[9]、苜蓿[10]、香蕉[11]等物种的钙调蛋白基因，并对其进化和表达进行了分析。在橡胶树中，仅有陈鑫等[12]利用RACE克隆了一个钙调蛋白基因HbCAM1，并利用RT-PCR技术对该基因在不同组织和乙烯利处理胶乳中的表达进行了初步分析。随着橡胶树基因组测序的完成，使人们能够对整个橡胶树钙调蛋白基因家族进行全面系统的分析。本研究从橡胶树转录组和基因组数据库中搜索并克隆得到7个钙调蛋白基因，并从基因结构、系统进化和表达模式几方面对这些家族成员进行了全面系统的分析。研究结果将有助于深入了解钙调蛋白基因家族成员在橡胶树生长发育和胁迫应答调控方面的重要功能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

本实验室Solexa测序所用的材料是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）热研7-33-97，其中胶乳、树皮、树叶、种子、雌花和雄花均来自中国热带农业科学院试验场三队的正常割胶橡胶树（开割2 a以上），根来自于中国热带农业科学院橡胶研究所种质资源圃华于伟老师赠送的热研7-33-9 组培苗；不同发育时期的橡胶树叶片来自于中国热带农业科学院橡胶所种质资源圃，为一年生的热研7-33-97嫁接苗；乙烯利处理的材料来自于海南省儋州市中国热带农业科学院试验场三队，品系为热研7-33-97，正常开割树（3天1刀，不涂乙烯利刺激），用1.5%乙烯利在不同时间处理橡胶树，相应4个时间点处理为0、3、12和24 h。

1.1.2 菌株与试剂

反转录试剂盒购自Fementas公司；pMD18-T载体和Taq DNA聚合酶均购自Takara公司；引物合成和测序由华大生物技术有限公司完成；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；其它生化试剂和常规试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 不同组织RNA的提取与cDNA合成

橡胶树胶乳RNA的提取参照Tang等[13]的方法；除胶乳以外其他组织的RNA提取方法参照Kiefer等[14]的方法；cDNA第一条链的合成采用反转录试剂盒，操作步骤按照Fementas公司产品说明书进行。

1.2.2 cDNA全长和基因组序列的克隆

利用拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列，通过本地BLAST搜索本实验室EST数据库，得到7个钙调蛋白基因的cDNA片段。然后设计特异性引物进行PCR扩增（表1），具体反应体系如下：模板（胶乳cDNA）0.5 μL、10×PCR Buffer 2 μL、Taq plus DNA Polymerase（5 U/L） 0.3 μL、dNTPs（2.5 mmol/L） 1.6 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 13.6 μL，共20 μL体系。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸10 min。扩增完成后，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段，并连接到pMD18-T载体上，最后送公司测序。

1.2.3 生物信息学分析

利用NCBI在线软件ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）进行ORF阅读框预测，利用生物软件DNAMAN对橡胶树和拟南芥的CaM氨基酸序列进行多序列比对。利用在线软件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析钙调蛋白基因的外显子/内含子组织结构。利用MEGA 6.0软件构建系统进化树，采用Neighbor-Joining方法进行分子系统学分析，并进行1 000次bootstrap统计学检验。

1.2.4 基因的表达模式分析

利用高通量测序数据[15]（Solexa转录组测序数据）对橡胶树钙调蛋白基因在不同组织、不同叶片发育时期和乙烯利处理下的表达进行分析。具体分析流程包括：对原始数据去除低质量序列，利用程序RSEM进行表达分析[16]和数据处理作图3个部分，其中前2步在本地服务器完成。

2 结果与分析

2.1 橡胶树钙调蛋白基因的克隆与序列分析

本研究以拟南芥和杨树钙调蛋白氨基酸序列为探针，利用tblastn搜索本实验室的EST数据库，分离并克隆得到了7个橡胶树钙调蛋白基因的cDNA序列，命名为HbCaM1-7（对应序列的NCBI登陆号为：HbCaM1，AJJZ010938311.1；HbCaM2，AJJZ010269732.1；HbCaM3，AJJZ010929368.1；HbCaM4，AJJZ010665409.1；HbCaM5，AJJZ010127638.1；HbCaM6，AJJZ010231096.1；HbCaM7，AJJZ010372997.1）。通过NCBI在线软件CDD分析，结果发现这7个基因均具有钙调蛋白基因所特有的保守结构域（图1）。经序列分析结果发现，HbCaM1-7的CDS序列均为450 bp，编码149个氨基酸，分子量为16.8 ku，等电点为3.95。其中，HbCaM1-6之间氨基酸同源性为100%，HbCaM7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%，各成员之间CDS序列同源性为80.4%～96.4%。

2.2 基因结构和进化分析

利用在线软件GSDS 2.0，对橡胶树钙调蛋白基因的外显子/内含子组织结构进行分析（图2）。分析结果发现，各家族成员在内含子数目和相对位置都非常一致，而内含子的長度却存在一定的差异。为了比较橡胶树和其他植物钙调蛋白在进化上的相互关系，选取了杨树（Populus trichocarpa， Pt）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，At）、水稻（Oryza sativa，Os）、蓖麻（Ricicus communis，Rc）及7条橡胶树（Hevea brasiliensis，Hb）钙调蛋白氨基酸序列，利用软件MEGA 6.0采用Neighbor-Joining法构建进化树，并进行1 000次bootstrap统计学检验（图3）。从图3中可看出，很多家族成员聚在一条直线上，说明这些成员之间的亲缘关系比较近，这和植物钙调蛋白氨基酸序列的高度保守性是一致的，例如橡胶树中HbCaM1-6虽然核苷酸序列存在差异，但氨基酸序列却是完全一致的，类似的还有拟南芥中AtCaM2-5、杨树中的PtCaM2-4等。植物钙调蛋白在进化上的保守性也说明其在功能上的重要性。

2.3 橡胶树钙调蛋白基因家族成员的表达分析

利用本实验室Solexa高通量测序数据对7个橡胶树钙调蛋白基因在不同组织、不同叶片发育时期和乙烯利处理后不同时间点的表达情况进行分析。其中不同组织包括胶乳、树皮、树叶、根、种子、雌花和雄花。结果表明，虽然7个家族成员在序列上具有较高的同源性，但在表达方面却存在着一定的差异（图4）。各家族成员在所检测的各组织中普遍表达，除了HbCaM3在种子中表达丰度最高，其他成员均是在胶乳中表达丰度最高，而HbCaM7在各组织中的表达丰度都很低，这说明橡胶树钙调蛋白基因在胶乳信号传导方面可能发挥着重要作用。

乙烯刺激对橡胶树胶乳中基因表达的影响结果见图5。由图5可知，乙烯利刺激3 h后，橡胶树钙调蛋白各家族成员的表达均有一定的上升趋势，其中HbCaM4和HbCaM6的变化趋势相对更加明显。据此推测，橡胶树钙调蛋白基因参与了橡胶树胶乳乙烯信号应答相关通路。橡胶树钙调蛋白基因家族成员在叶片发育过程中的表达情况见图 6，除了HbCaM7基因外，其他各成员在叶片发育过程中的表达均呈下降趋势，在稳定期的表达明显低于其他各时期。这说明橡胶树钙调蛋白基因可能参与了橡胶树叶片生长发育相关的调控。

3 讨论与结论

钙调蛋白在调控植物生长发育和参与植物逆境胁迫应答等方面具有重要作用。通过对拟南芥钙调蛋白基因家族的研究发现，不同家族成员在拟南芥生长发育的不同阶段具有不同的表达丰度，一叶期AtCAM4表达丰度最高，二叶期AtCAM2表达丰度最高，而到四叶期AtCAM1、AtCAM4、AtCAM5和AtCAM7具有较高的表达丰度[17]。在胁迫应答方面，研究结果发现，拟南芥大部分钙调蛋白基因家族成员都参与了胁迫和激素刺激相关应答反应[18]。程晓培等[19]对逆境胁迫下MaCAM的表达进行分析，结果发现MaCAM明显盐胁迫、干旱和低温诱导。在水稻中，通过分析基因家族成员在不同组织中的表达，结果发现，各家族成员在叶片和花中的表达明显高于根和种子等其他组织[20]。本研究结果发现，除了HbCaM3在种子中表达丰度最高，其他各成员均在胶乳中表达丰度最高，并且在乙烯利刺激后大部分成员的表达都有一定的上升趋势，这说明橡胶树钙调蛋白参与了橡胶树乳管逆境胁迫应答相关信号通路。另外，通过研究橡胶树钙调蛋白各家族成员在叶片发育过程中的表达，结果发现，所有成员在叶片发育过程中的表达均呈下降趋势，在稳定期叶片中的表达最低，这说明钙调蛋白参与橡胶树叶片生长发育相关的信号调控，并且更多在代谢较活跃的组织中表达。本研究从基因结构、系统进化和表达模式几方面对橡胶树钙调蛋白各家族成员进行了系统的分析。研究结果将有助于深入了解钙调蛋白基因家族成员在橡胶树生长发育和胁迫应答等方面的重要功能。

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