单纤维传导检测对糖尿病大鼠运动神经损害的早期诊断价值

田丽，刘娜，郑丽娜，朱炬，张哲成

(天津市第三中心医院，天津300170)



单纤维传导检测对糖尿病大鼠运动神经损害的早期诊断价值

田丽，刘娜，郑丽娜，朱炬，张哲成

(天津市第三中心医院，天津300170)

目的以糖尿病大鼠坐骨神经超微结构改变作为客观依据，探讨单纤维传导检测对糖尿病大鼠运动神经损害的早期检测价值。方法 选取SD大鼠37只，随机分为对照组19只、糖尿病组18只；糖尿病组经腹腔注射链脲佐菌素诱导成糖尿病大鼠模型。在造模第4、8、12周对糖尿病组及对照组进行坐骨神经单纤维传导速度(SF-CV)、单纤维传导末端运动潜伏期(SF-DML)及坐骨神经运动传导速度(MCV)、末端运动潜伏期(DML)、复合肌肉动作电位(CMAP)检测，并利用电镜观察大鼠坐骨神经的超微结构，比较两组大鼠不同时期各项神经电生理指标、电镜观察结果的差异。结果 造模第4周，糖尿病组大鼠坐骨神经SF-CV、SF-DML、MCV、DML、CMAP与对照组比较无统计学差异(P均>0.05)；电镜显示糖尿病组大部分神经纤维尚正常。第8周，糖尿病组左侧坐骨神经SF-CV较对照组减低、SF-DML较对照组延长(P均<0.05)；电镜显示糖尿病组坐骨神经可见髓鞘明显损害。第12周，糖尿病组右侧坐骨神经SF-CV、MCV较对照组减低， SF-DML、DML较对照组延长，CMAP较对照组减低(P均<0.01)；电镜观察糖尿病组坐骨神经严重受损。结论 单纤维传导检测可早期发现糖尿病大鼠运动神经纤维异常。

糖尿病；周围神经病变；单纤维传导；运动神经传导；电镜;大鼠

糖尿病周围神经病变(DPN)初期大多为肢端麻木疼痛自觉症状，而运动神经损害表现轻微，往往被忽视且不易被临床、神经电生理检查发现。单纤维传导检测利用单纤维针电极记录面积小的特点,可选择性测量一小组或者单个神经纤维的运动传导，有利于发现早期、轻度或者部分神经损伤。因此我们利用单纤维传导检测技术对糖尿病大鼠坐骨神经运动纤维进行评价，探讨其对糖尿病运动神经纤维损害的早期诊断价值。

1　材料与方法

1.1 实验动物及处理 健康雄性SD大鼠37只(由北京大学医学部动物中心提供)，体质量为180～220 g。适应性饲养1周后采用随机数字表法将大鼠随机分为对照组19只、糖尿病组18只。糖尿病组大鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病模型，对照组大鼠仅给予注射等量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。造模第4周末，两组各取8只进行右侧坐骨神经电生理检测，并另取其中1只大鼠的右侧坐骨神经标本行电镜观察；第8周末，对以上两组所取8只大鼠再行左侧坐骨神经电生理检测后处死，并取其中1只大鼠的左侧坐骨神经标本行电镜观察。第12周末，对照组10只、糖尿病组9只大鼠进行右侧坐骨神经电生理检测后处死，并取其中1只大鼠坐骨神经标本行电镜观察。

1.2 神经电生理检测 将大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，俯卧固定于平板上。环境温度22～25 ℃。应用美敦力Keypointnet肌电图仪进行神经电生理检测，带通2～100 kHz。①运动神经传导检测：参照 Terata等[1]方法，根据大鼠坐骨神经走向，采用单极针经皮插入作为刺激电极；第1刺激点阴极置于坐骨切迹，阳极旁开5 mm；第2刺激点阴极置于同侧内踝后方，阳极旁开5 mm，用方形波(强度5～15 mA、脉宽0.2 ms)刺激神经。以单极针电极作为记录电极，阴极插入右足底骨间肌，阳极插入右足底皮下，地线置于尾部皮下。分别测量末端运动潜伏期(DML)和复合肌肉动作电位(CMAP)、运动神经传导速度(MCV)。②单纤维传导检测：包括单纤维传导速度(SF-CV)及单纤维传导末端运动潜伏期(SF-DML)检测。参照 Terata等[1]方法，以单纤维针电极作为记录电极，插入右足底骨间肌，地线置于尾部皮下。分别测量SF-DML及SF-CV。SF-DML为由内踝后方刺激开始至单纤维动作电位起始点之间的时间。SF-CV 为两个刺激部位之间的距离/两刺激部位潜伏期差值。移动单纤维针电极以获得3个不同记录点的SF-CV及SF-DML数值，并取平均值。

1.3电镜观察取坐骨神经组织，即刻投入预冷的电镜固定液中送检，标本经2.5%戊二醛固定液、1%四氧化锇固定，上升梯度乙醇脱水，环氧丙烷过渡，Epon812环氧树脂包埋。经半薄切片定位后，以LEICA ULTRACUT-R超薄切片机制备超薄切片，厚度50 nm；醋酸铀及柠檬酸铅双重染色，HITACHI-7500透射电镜观察，Megaview数字化电镜摄影系统摄片。

2　结果

2.1 糖尿病大鼠模型造模情况 糖尿病组大鼠腹腔注射STZ后第1、8、12周，尾静脉取血测血糖，血糖水平分别为(25.45±3.93)、(23.06±4.3)、(23.23±3.59) mmol/L；对照组血糖水平分别为(5.06±0.54)、(5.14±0.52)、(5.39±0.70) mmol/L。两组血糖比较差异有统计学意义(P均<0.01)。

2.2造模第4周两组神经电生理、电镜检查结果两组右侧坐骨神经SF-CV、SF-DML、MCV、DML、CMAP差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。电镜观察：对照组坐骨神经髓鞘、轴索完整，微管微丝正常，神经髓鞘板层规则、整齐。糖尿病组可见坐骨神经轻微损伤，低倍镜观察大部分神经纤维尚正常，高倍镜观察部分神经髓鞘局灶板层熔融，出现小裂隙。

表1　造模第4周两组右侧坐骨神经电生理检查结果比较±s)

2.3造模第8周两组神经电生理、电镜检查结果糖尿病组左侧坐骨神经SF-CV较对照组减低(P<0.05)，SF-DML较对照组延长(P<0.05);MCV、DML、CMAP较对照组无统计学差异(P均>0.05)。见表2。电镜观察：对照组坐骨神经超微结构正常。糖尿病组坐骨神经可见明显髓鞘损害，髓鞘板层松散、分离，结构不清，外侧部分有熔融灶。

表2　 造模第8周两组左侧坐骨神经电生理检测结果比较±s)

2.4造模第12周两组神经电生理、电镜检查结果糖尿病组右侧坐骨神经SF-CV、MCV较对照组减低(P均<0.01)， SF-DML、DML较对照组延长(P均<0.01)，CMAP较对照组减低(P<0.01)。见表3。电镜观察：对照组坐骨神经组织超微结构正常。糖尿病组坐骨神经受损严重，髓鞘板层结构破坏，蓬松变厚，有折叠、熔融，轴索受挤压，轴索内微管微丝紊乱。

表3　 造模第12周两组右侧坐骨神经电生理检测结果比较±s)

3　讨论

DPN起病隐匿，患者常因肢体麻木、疼痛等感觉症状就诊，早期电生理表现以感觉神经纤维受损为主，小纤维受累明显[2]，临床及电生理检测对运动神经纤维的关注度较低。而糖尿病运动神经纤维的损害可导致肌肉无力、肌容积减少，增加跌倒风险，在DPN早期并不易被发现[3]。

单纤维传导检测是基于单纤维肌电图而发展起来的神经电生理技术[4, 5]，2007年开始有研究者以单纤维针电极代替表面电极作为记录电极进行单纤维传导检测[6]。由于单纤维针电极侧孔的记录范围远小于表面电极的记录范围[7]，因此将其应用于传导速度检测时，可以收集少量肌纤维电位，进一步计算少量甚至单个神经纤维的传导速度，利于发现早期、轻度运动神经纤维功能异常。

Padua等[8]在常规运动神经传导正常糖尿病患者发现SF-CV下降。我们前期的研究将SF-CV检测应用于腕管综合征患者及糖尿病患者，显示SF-CV检测较常规运动神经传导检测对周围神经运动纤维早期损害诊断更为敏感[9, 10]。但是神经电生理显示的结果异常是否与DPN的病理性改变相一致，是否能反映周围神经的真实状况，应进一步行病理学观察。鉴于无法对糖尿病患者运动神经纤维活检取材检测，故本文利用糖尿病大鼠模型进行研究。Shi等[11]测定正常大鼠坐骨神经MCV为50 m/s。本研究结果为51.45 m/s。与其基本一致。陈伟等[12]发现糖尿病大鼠造模后4周时少数腓肠神经纤维髓鞘扭曲，部分髓鞘松散。Souayah等[13]在小鼠高血糖后4周即观察到运动神经纤维末端侧支芽生，提示糖尿病的早期阶段即出现运动神经纤维损害，而高血糖后6周，MCV及CMAP仍为正常。本研究在糖尿病造模后4周电镜观察坐骨神经也发现少量神经髓鞘局灶性损害，神经电生理检测与正常对照组相比均未发现差异。8周时电镜观察局灶性髓鞘板层松散、分离，此时糖尿病大鼠MCV、DML及CMAP检测均未显示异常，但应用单纤维传导检测将神经分为若干小部分进行研究，发现了SF-CV下降及SF-DML延长，显示单纤维传导较运动神经传导检测更易于发现早期部分的神经损害。卫重娟等[14]发现糖尿病大鼠造模后15周坐骨神经MCV下降。本研究中发现DM大鼠高血糖后12周出现坐骨神经MCV下降，CMAP减低，单纤维传导异常进一步加重。此检测结果与电镜显示髓鞘折曲、轴索受挤压等严重损害基本一致。电镜证实的糖尿病大鼠模型的周围神经损害，为单纤维传导检测早期发现糖尿病周围神经运动纤维异常的应用价值提供了客观支持依据。

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