亚低温联合高压氧干预对大鼠神经干细胞RhoA/RHOCK通路的影响

王东，付红杰，张建军，李超

(天津市第四中心医院，天津300140)



亚低温联合高压氧干预对大鼠神经干细胞RhoA/RHOCK通路的影响

王东，付红杰，张建军，李超

(天津市第四中心医院，天津300140)

目的探讨亚低温联合高压氧干预通过RhoA/RHOCK通路对神经干细胞凋亡、增殖、分化的影响。方法 制作大鼠神经干细胞液压损伤模型，并随机分为4组。常温组不进行任何干预；亚低温干预组于伤后1 h进行(32±0.5)℃亚低温治疗4 h；高压氧组予以高压氧干预；联合组在亚低温干预同时予以高压氧干预。采用免疫荧光检测神经干细胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR基因及蛋白表达，激光共聚焦显微镜根据荧光强度值计算神经干细胞内Ca2+浓度，TUNEL法检测神经干细胞凋亡情况。结果 体外损伤模型神经干细胞造模后72 h，联合组、高压氧组、亚低温组神经干细胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR基因及蛋白表达较常温组明显降低(P均<0.05)，联合组比高压氧组、亚低温组降低更明显(P均<0.01)。常温组、亚低温组、高压氧组、联合组神经干细胞细胞内Ca2+浓度分别为(286.6±34.7)、(236.6±21.4)、(234.6±19.0)、(202.6±15.0)nmol/L，组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。常温组、亚低温组、高压氧组、联合组神经干细胞凋亡率分别为(24.76±0.16) % 、(19.13±0.84)%、(18.13±0.76)%、(10.13±0.26)%，组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 亚低温治疗能通过影响RhoA/RHOCK通路发挥调控神经干细胞凋亡、增殖、分化的作用。

脊髓损伤；亚低温； 高压氧；神经干细胞；RhoA/ROCK通路；大鼠

脊髓损伤后神经不能再生、修复，是导致患者致残、致死率增高的根本原因。RhoA/RHOCK通路是调节脊髓损伤后神经轴突再生的重要信号通路，与神经干细胞的增殖、分化密切相关[1]。大量临床研究证明，亚低温能有效减轻继发性脑和脊髓损伤，对中枢神经损伤有确切的保护作用；同时亚低温改善脊髓损伤区域的微环境，有利于移植细胞的增殖、活化、生长[2～4]。2015年1～6月，我们采用亚低温联合高压氧干预大鼠损伤造模神经干细胞，检测RhoA/RHOCK通路表达情况，探讨亚低温联合高压氧对神经干细胞凋亡、增殖、分化的作用。

1　材料与方法

1.1神经干细胞培养、鉴定 取孕14～16 d的Wistar大鼠1只，引颈处死，75%乙醇浸泡消毒。打开鼠腹取出胎鼠，将胎鼠大脑浸泡在DMEM/F12液中，去除脑膜和血管，用吸管反复吹打成悬液，过100目孔筛网。过滤悬液接种于培养瓶中，于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养。在原代培养到第3天时，对培养细胞进行Nestin免疫荧光染色鉴定，完成PKH2染色标记过程。苔盼蓝试验检测存活率﹥90%，提示标记后细胞存活。免疫荧光染色显示神经干细胞球呈Nestin强阳性表达。

1.2神经干细胞损伤模型制备及分组自行设计液压冲击装置，该装置由压力表、50 mL注射器、三通管、摆锤(4.8 kg)、打击架、培养瓶组成。将原代培养神经干细胞培养瓶中充满培养液，通过三通管连接于液压装置中的压力表和注射器(内含25 mL培养液)的一端。摆锤连接于打击架上，从一定高度落下，打击注射器的另一端活塞，其产生的压力经注射器液体传递至培养瓶中的培养细胞层，对细胞造成损伤，冲击压力3.0 kP，作用时间20～30 s。制备大鼠神经干细胞液压损伤模型随机分为常温组、亚低温干预组、高压氧组、联合组4组，每组设6个样本。常温组神经干细胞常温放置；亚低温干预组神经干细胞于损伤后1 h进行亚低温干预4 h，温度为(32±0.5)℃；高压氧组予以高压氧干预；联合组亚低温干预同时予以高压氧干预。

1.3神经干细胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR基因及蛋白表达检测亚低温干预4 h后将各组神经干细胞在玻璃盖片上用甲醇在-20 ℃固定10 min，然后用兔抗大鼠RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR抗体(1∶200) 4 ℃孵育16 h；PBS溶液冲洗30 min，FITC标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶1 000)室温孵育1 h，再用PBS溶液冲洗30 min。神经干细胞造模后72 h，采用免疫荧光检测神经干细胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR基因及蛋白表达。

1.4神经干细胞内Ca2+浓度测定亚低温干预4 h后，在盖玻片上培养的神经干细胞经PBS冲洗3次，于37 ℃条件下用终浓度为10 μmol/L的Fluo-3/AM(美国Bio-Rad公司)负载45 min。盖玻片倒置密封小室上，用Insight-Plus IQ型激光共聚焦显微镜(美国Meridian公司)以488 nm氢激光激发而产生荧光，测定其荧光强度。根据荧光强度值计算神经干细胞内Ca2+浓度。

1.5神经干细胞凋亡率检测亚低温干预4 h后，采用TUNEL法检测神经干细胞凋亡，主要过程按试剂盒说明书进行。用DAB显色，显微镜下观察，细胞核被染呈棕色或棕褐色为阳性，即凋亡细胞。随机选5个视野，400倍光镜下计数凋亡细胞，计算凋亡率。

2　结果

2.1各组神经干细胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR mRNA表达见表1。

表1　　　　各组RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR mRNA表达比较

注：与常温组比较，△P<0.05，#P<0.01。

2.2各组神经干细胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR蛋白表达见表2。

表2　各组RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR 蛋白表达比较

注：与常温组比较，△P<0.05，#P<0.01。

2.3各组神经干细胞内钙离子浓度神经干细胞内钙离子浓度常温组、亚低温组、高压氧组、联合组分别为(286.6±34.7)、(236.6±21.4)、(234.6±19.0)、(202.6±15.0)nmol/L，组间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.4各组神经干细胞凋亡率常温组、亚低温组、高压氧组、联合组神经干细胞凋亡率分别为(24.76±0.16)%、(19.13±0.84)%、(18.13±0.76)、(10.13±0.26)%，各组间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

3　 讨论

脊髓损伤后神经不能再生、修复是导致患者致残及病死率增高的根本原因。神经干细胞具有自我增殖能力以及多向分化的潜能,在一定条件下可以分化成神经系统中的各种细胞,因此在神经损伤修复方面有着良好的应用前景。研究表明神经干细胞分化、增殖不局限于其来源区域，具有很强的可塑性。神经干细胞的分化主要受基因调控，基因表达方式受其自身固有分子程序的调控和周围微环境的影响[5～7]。

大鼠脊髓损伤后，脊髓损伤区产生的轴突抑制因子，通过对RhoA的调控，导致RhoA/RHOCK通路异常，神经干细胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR mRNA、蛋白表达增强，引起RhoA/RHOCK通路激活、信息传导抑制等一系列反应，最终使脊髓神经组织生长锥塌陷，抑制轴突再生[8，9]。RhoA/RHOCK信号通路传导过程中，RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR蛋白能提高神经干细胞内Ca2+浓度；Ca2+超载时可激活多种蛋白水解酶，其中钙依赖性中性蛋白酶是一重要的蛋白水解酶，其所作用的底物为细胞骨架蛋白。微管相关蛋白-2(MAP-2)是细胞骨架中微管的重要组成成分之一，它可促进微丝聚合成微管，提高微管的稳定性。亚低温联合高压氧能降低神经干细胞内RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR蛋白表达，抑制神经干细胞内Ca2+超载，阻断蛋白水解酶的激活，保护MAP-2正常表达，维持细胞骨架结构稳定，促进神经细胞存活、增殖。亚低温联合高压氧能抑制脊髓损伤后炎性因子的释放，抑制脊髓损伤区凋亡基因、轴突生长抑制相关基因的表达，对RhoA/RHOCK通路激活环节产生完全阻断或部分阻断作用，封闭细胞内抑制信号的传导。

大量临床研究证明，亚低温能有效减轻继发性脑和脊髓损伤，对脊髓损伤有确切的保护作用；同时亚低温能改善脊髓损伤区域的微环境，有利于移植细胞的增殖、活化、生长[10～12]。本研究采用亚低温联合高压氧干预大鼠损伤造模神经干细胞，检测RhoA/RHOCK通路表达情况、神经干细胞内Ca2+浓度及神经干细胞凋亡情况，显示联合组、高压氧组、亚低温组神经干细胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR基因及蛋白表达较常温组明显降低，联合组比高压氧组、亚低温组降低更明显。联合组、亚低温组和高压氧组的神经干细胞内Ca2+浓度低于常温组，联合组较亚低温组和高压氧组神经干细胞内Ca2+浓度降低明显。表明亚低温及高压氧都能降低神经干细胞内Ca2+浓度，两者联合具有协同作用。联合组神经干细胞凋亡率低于高压氧组和亚低温组，说明亚低温和高压氧均能够减轻损伤神经干细胞的凋亡，两者联合作用更明显。

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天津市卫计委科技基金资助项目(2015KR20)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.33.011

R651.2

A

1002-266X(2016)33-0034-03

2016-02-10)