心抑瘤素M及其受体在压力负荷致心肌肥厚小鼠心肌组织中的表达及意义

沈涤非，袁园，吴青青，邓伟，倪健，唐其柱

(武汉大学人民医院·武汉大学心血管病研究所·心血管病湖北省重点实验室，武汉430060)



心抑瘤素M及其受体在压力负荷致心肌肥厚小鼠心肌组织中的表达及意义

沈涤非，袁园，吴青青，邓伟，倪健，唐其柱

(武汉大学人民医院·武汉大学心血管病研究所·心血管病湖北省重点实验室，武汉430060)

目的探讨心抑瘤素M(OSM)/ OSM受体(OSMR)在压力负荷致心肌肥厚小鼠心肌组织中的表达及其意义。方法 选择野生型C57BL/6J小鼠60只，随机分成为假手术组(Sham组)、模型组(AB组)各30只，AB组采用胸主动脉缩窄术建立心肌肥厚模型。两组于术后4周行超声检测心功能，处死后观察心脏大体观并行心肌组织病理学检测。应用RT-PCR检测小鼠心肌组织OSM、IL-31、OSMR mRNA表达，应用Western blotting检小鼠心肌组织测OSM、IL-31、OSMR亚单位(OSMRβ)蛋白表达。结果 术后4周，大体观察显示AB组小鼠心脏体积增大，心腔扩大，病理染色显示心肌细胞横截面积增加。与Sham组相比，AB组舒张期室间隔厚度、左室舒张末内径和左室收缩末内径增大，射血分数及短轴缩短率减小(P均<0.05)；AB组心肌OSM mRNA、OSM蛋白、OSMR mRNA、OSMRβ蛋白表达均较Sham组明显上调(P<0.05或<0.01)。结论 压力负荷致心肌肥厚模型小鼠心肌组织中OSM及其OSMRβ均发生异常表达， OSM/OSMRβ系统参与了心肌重构导致心肌肥厚的过程。

心肌肥厚；心抑瘤素M；心抑瘤素M受体亚单位；压力负荷；IL-31;小鼠

心肌肥厚是心脏为了适应增加的血流动力学需求而产生的一种代偿机制，是高血压、心肌梗死、瓣膜病等多种心血管疾病的共同病理生理过程。在器官水平表现为心脏尤其是左心室肥大、室壁增厚、室壁韧性下降，细胞水平表现为心肌细胞增大、间质细胞增殖并产生大量胶原沉积使纤维组织增多。这些变化的不断积累使心肌顺应性和心功能下降，最终心脏的泵血功能无法满足机体需要而发生心力衰竭。目前，尚无心抑瘤素M(OSM)/ OSM受体(OSMR)亚单位(OSMRβ)在心肌肥厚中的相关研究报道。2015年3月～2016年3月，我们对此进行了研究。

1　材料与方法

1.1动物及分组野生型C57BL/6J雄性小鼠60只，8周龄，体质量24～27g。随机分为假手术组(Sham组)、模型组(AB组)各30只。

1.2心肌肥厚动物模型建立AB组采用胸主动脉缩窄建立小鼠心肌肥厚模型。经戊巴比妥钠麻醉小鼠，沿第2～3肋间水平切开皮肤，依次分离肌肉及软组织，游离胸主动脉，将7-0手术缝线穿过主动脉，将去尖的27号针头连同主动脉一起结扎，然后立即抽出针头，造成主动脉70% 狭窄后，逐层缝合切口。术后4周进行实验观察。假手术组只在分离主动脉后穿过一条短丝线，不作结扎，其他手术步骤同AB组。

1.3超声检测心功能术后4周，异氟烷吸入性麻醉小鼠，将小鼠左胸前区剃毛，涂抹耦合剂，取左侧卧位或仰卧位对小鼠行超声检查。选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量小鼠左室收缩末内径(LVESD)、左室舒张末内径(LVEDD)、舒张期室间隔厚度(IVSD)、左心室后壁厚度(LVPWD)、射血分数(EF)以及短轴缩短率(FS)。采用设备为高频超声诊断仪, 频率为15 MHz。

1.4心肌组织病理学检查超声检测后处死小鼠，取出小鼠心脏，用滤纸吸干血液后肉眼观察心脏大体观。每组都各取10个心脏加入10倍量 4%多聚甲醛固定后24 h后将小鼠心脏放于翻拍板上用照相机(尼康D700)拍大体心脏。将拍完后的心脏脱水、石蜡包埋、切片厚度4 μm, 每个心脏各切18张)。切片进行常规HE染色和FITC标记的麦胚芽凝集素染色。

1.5心肌组织OSM、IL-31、OSMR mRNA 表达检测采用RT-PCR法。使用TRIzol提取心肌组织中的总RNA，分光光度计测量A260、A280，以A230/A260比值计算RNA的提取量和纯度。使用寡脱氧核糖核苷酸引物和PCR仪将RNA逆转录为cDNA。采用LightCycler 480 SYBR®Green 1 Master Mix体系进行PCR扩增：5 min 95 ℃变性，之后开始42次引物扩增循环。PCR结果使用双重标准化曲线来量化，使用GAPDH mRNA表达进行校准。

1.6心肌组织OSM、IL-31、OSMRβ蛋白表达检测采用Western blotting法。将心肌组织匀浆溶于裂解缓冲液中，采用BCA法测量蛋白浓度。将组织裂解产物使用10%SDS-PAGE胶进行分离，然后转移到PVDF膜上，再使用5%脱脂牛奶封闭2 h。孵育一抗4 ℃过夜。37 ℃孵育二抗1 h，使用双色红外成像系统进行扫膜分析。

2　结果

2.1两组心脏组织及超声检查各项指标比较术后4周，AB模型组小鼠大体观察显示心脏体积增大，心腔扩大；病理染色显示心肌细胞横截面积增加。与Sham组相比，AB模型组小鼠超声检查IVSD、LVEDD和LVESD增大(P均<0.05)，EF 和FS 减小(P均<0.05)。见表1。

表1　两组心脏超声检查各项指标比较±s)

注：与Sham组比较,*P<0.05。

2.2两组心肌组织OSM、IL-31、OSMR、OSMRβ的表达与Sham组相比，术后4周AB组心肌OSM mRNA、OSMR mRNA表达升高(P均<0.01)，OSM蛋白、OSMRβ蛋白表达上调(P均<0.05)；而IL-31mRNA和蛋白表达无明显变化。见图2、图3。

注：与Sham组比较，*P<0.05，#P<0.01。

图1 OSM、IL-31和OSMR mRNA在心肌组织的表达

注：与Sham组比较，*P<0.05，#P<0.01。

图2OSM、IL-31和OSMRβ 蛋白在心肌组织的表达

3　讨论

OSM最早是从U937组织型瘤细胞的培养上清中分离出的一种对A375黑色素瘤细胞生长有抑制作用的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞、T淋巴细胞和单核细胞表达产生，在骨髓、脾脏等组织也有表达，但在肝脏、肺、卵巢、小肠、肾脏以及脑组织检测不到其表达[1]。OSM、IL-6、IL-11和白血病抑制因子(LIF)以及IL-31等细胞因子都属于IL-6或糖蛋白130(gp130)细胞因子家族，该家族成员的生物活性具有多样化的特点，在细胞分化增殖、血细胞生成、免疫调节、炎症应答和协调细胞因子功能等方面发挥着广泛而重要的作用[2]。该家族细胞因子通过结合gp130二聚体或gp130与其他受体蛋白形成的异二聚体受体激活其下游信号通路，发挥其生物学效应[3,4]。

OSMR有两型，其中OSMⅡ型受体是由OSMR基因编码的OSMRβ蛋白和gp130组成的异二聚体受体。同时，OSMRβ和IL-31RA组成的异二聚体也构成了IL-6细胞因子家族另一成员，即IL-31受体复合物。OSMRβ 表达范围广泛，几乎分布于人体所有的器官和组织，在不同的器官和组织，以及同一器官或组织的不同类型细胞间表达存在差异[5]。IL-6细胞因子家族成员LIF在心肌肥厚的心脏表达增高，通过LIFRβ和gp130形成的异二聚体受体激活ERK1/2信号途径导致Th细胞水平下降[6]。同时，生长相关蛋白43、Collapsin反应调节蛋白以及多唾液酸神经细胞黏附分子等幼稚神经元标志物表达上调。而且升高的LIF和心肌营养素-1通过gp130信号通路上调副交感神经标志物如胆碱乙酰基转移酶和胆碱转运蛋白的表达, 引起交感神经向胆碱能神经转移分化[7]。

本研究成功建立了压力负荷致心肌肥厚小鼠模型。术后4周，IL-31主要由活化的CD4+T淋巴细胞(尤其是Th2辅助T淋巴细胞)、主细胞、单核细胞/巨噬细胞以及树突状细胞产生，其主要作用于皮肤、肺、肠道组织以及神经系统。目前的研究提示，IL-31主要与过敏性疾病发生相关[8,9]。本研究AB组IL-31在心肌组织mRNA及蛋白与Sham组无明显差异，提示IL-31可能未参与AB组小鼠心肌重构的过程。而OSMR/OSMRβ在AB组小鼠心肌组织表达显著增加，说明OSM/OSMR信号系统在心肌肥厚小鼠心肌重构过程中被激活，且可能在这一过程中起到重要作用。

目前，OSM/OSMRβ信号途径在心血管疾病相关研究较少，其在心脏疾病的发生发展过程中的作用还存在争议[10]。OSMR基因缺陷小鼠在正常饮食情况下于16周出现胰岛素抵抗，32周出现肥胖、严重的肝脂肪变性和胰岛素抵抗[11]，说明OSMR基因可能与组织代谢调节相关。对于缺血性心脏病，OSM/OSMRβ信号系统具有心脏保护作用。在缺血/再灌注的糖尿病小鼠模型中，该系统激活可减少心肌细胞凋亡，促进线粒体的生物合成，增强心肌胰岛素敏感性[12]。另外，OSM/OSMRβ信号激活可诱导心肌细胞去分化，并使心肌细胞分泌巨噬细胞转运调节因子Reg3β增加。巨噬细胞在受损的心脏组织聚集，可移除中性粒细胞，减少组织降解，在心肌梗死早期促进心肌修复和重构，保护应激状态下的心功能[13, 14]。而对于扩张型心肌病而言，抑制OSM信号途径的激活，可抑制扩张型心肌病小鼠模型心肌重构，改善扩张型心肌病小鼠心功能。说明OSM信号途径的持续激活，对心脏结构和功能的长期稳定不利[14,15]。

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唐其柱(E-mai:qztang@whu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.33.010

R542.2

A

1002-266X(2016)33-0031-03

2016-06-27)